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免疫胶体金试纸法验证甲状旁腺的临床应用研究*

2019-04-18

中国肿瘤临床 2019年23期
关键词:胶体金试纸血钙

甲状腺癌发病率在中国呈逐年上升趋势[1],根据最新数据,其发病率已上升为中国恶性肿瘤人群第10 位,更是城市女性中发病风险较高的癌症之一[2]。甲状腺肿物以手术切除为主,术中误伤甲状旁腺造成的低钙血症是重要并发症。2018年美国甲状腺学会关于成人患者术后甲状旁腺功能减退症的诊断、预防及管理声明[3]指出双侧(同期或分期)甲状腺切除术最易导致术后低钙血症,随甲状旁腺枚数的减少,低钙血症的发生率将逐渐增高[4]。

利用术中免疫胶体金试纸法快速测定组织内甲状旁腺素(PTH)水平,从而提高甲状旁腺辨识度,相关研究国内外鲜见报道。本研究借助免疫胶体金技术,术中细针穿刺法穿刺待测组织,获取洗脱液并利用该便携式仪器及配套试纸快速得到检验结果,利用术中病理冰冻、术前术后PTH及血钙水平、患者症状等,观察术中识别甲状旁腺的敏感度、特异度、准确性等,分析该技术可行性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2017年9月至2018年12月于云南省肿瘤医院接受双侧甲状腺全部切除患者进行前瞻性研究,共130例患者进行双侧甲状腺手术切除术。同时收集2015年1月至2016年1月同单位采用纳米碳技术行双侧甲状腺全切患者资料。所有手术均由同一组医生操作完成。相关手术及PTH检测均经云南省肿瘤医院伦理委员会备案,患者及家属均知情同意。将使用胶体免疫金试纸法进行术中PTH快速检测定义为试验组(74 例),使用纳米碳负显影技术识别甲状旁腺定义为对照组1(50例),常规肉眼法识别甲状旁腺定义为对照组2(56例)。

试验组和对照组1、对照组2 中央区淋巴结清扫范围为上界至甲状软骨,下界达胸腺,外侧界为颈动脉鞘内侧缘,包括气管前、气管旁、喉前淋巴结。3组患者清扫范围无差异。3 组患者手术中因解剖位置特殊或位于中央区淋巴结造成手术游离后血供较差,原位保留难以保证其功能者,均行甲状旁腺自体移植。

1.2 方法

1.2.1 检测方法 预期进行双侧甲状腺全切患者知情同意后纳入研究。术中采用双极、超声刀、电刀等器械综合运用的方法,在甲状腺表面剥离甲状旁腺时,手法轻柔,不用力牵拉,避免使用吸引器,以免将其拽下或误吸。根据精细化解剖,常规在甲状腺背侧据临床经验显露甲状旁腺,上旁腺通常位置固定,位于甲状腺后悬韧带区域,靠近食管后外侧缘,多在Zuckerkandle 结节后可发现上旁腺。而下甲状旁腺,变异较大,可位于甲状腺后缘中下1/3 交界范围,甲状腺前、甲状腺内、胸腺内或纵隔内,极易与脂肪或淋巴结混淆,因此主要进行下甲状旁腺鉴别。

对需要检测的可疑组织(图1)分别用1 mL无菌注射器,内含0.2 mL生理盐水带负压穿刺并抽吸目标组织3次(图2),并将上述针头在0.8 mL生理盐水中反复抽吸3次,取上述洗脱液95µL,滴加在免疫胶体金试纸条加样区,孵育10 min,反应完成后定性观察反应区条带;检测仪开机后,采用PTH常规检验模式,将加样后的试剂条置于检测区域读取PTH结果。由同一位医生加样和操作仪器进行PTH检测。每次免疫胶体金试纸法检测PTH耗时12~15 min,包括取样、加样、孵育、测量、读值等步骤,其中孵育部分耗时10 min。

图1 箭头处为需要进行鉴定的可疑甲状旁腺组织

1.2.2 结果判读 若试纸条显示出1条条带,则检测结果为阴性,既该组织为非甲状旁腺组织;若试纸条出现2 条条带,则检测结果为阳性,既该组织为甲状腺旁组织。根据设备使用说明,得到PTH值,若PTH值>65 ng/mL,检测结果为阳性,考虑该组织为甲状旁腺组织;若PTH 值≤65 ng/mL,则检测结果为阴性,考虑穿刺组织为非甲状旁腺组织。

1.3 统计学分析

以术中冰冻病理为金标准,甲状旁腺术中快速检测的敏感度与特异度的计算方法。真阳性=TP(ture positive):准确鉴定的甲状旁腺组织,即PTH>65 pg/mL且冰冻病理证实为甲状旁腺组织。真阴性=TN(ture negative):准确鉴定的非甲状旁腺组织,即PTH≤65 pg/mL且冰冻病理证实为非甲状旁腺组织。假阳性=FP(false positive):非甲状旁腺组织鉴定为甲状旁腺组织。即PTH>65 pg/mL 而冰冻病理证实为非甲状旁腺组织。假阴性=FN(flase negative):甲状旁腺误诊为非甲状旁腺,即PTH≤65 pg/mL而冰冻病理证实为甲状旁腺组织。敏感度(真阳性率)=TP/(TP+FN);特异度(真阴性率)=TN/(TN+FP);误诊率(假阳性率)=FP/(TN+FP);漏诊率(假阴性率)=FN/(TP+FN)。

图2 穿刺抽吸可疑组织:用1 mL无菌注射器,内含0.2 mL生理盐水带负压穿刺并抽吸目标组织

采用系统随机化法分组:常规肉眼组应用常规方法肉眼识别甲状旁腺(对照组2),免疫胶体金试纸法组患者加用免疫胶体金技术识别甲状旁腺(试验组),纳米碳组加用纳米碳技术识别甲状旁腺(对照组1)。分别于术前及术后第1 天常规检测两组血清PTH水平及钙离子水平,比较两组甲状旁腺功能减退发生率及低钙反应率,统计纳米碳组同样数据。

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料用表示。符合率用百分率(%)表示,组间比较采用t检验,配对四格表比较两个总体率用Fisher 确切概率法检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 可行性

免疫胶体金可定性及定量判读结果,PTH<65 ng/mL时,试纸检测线不显色;PTH 值≥65 ng/mL 时,检测线颜色深浅与样品中的PTH含量呈正比,即含量越高,颜色越深。使用免疫胶体金试纸法76 例患者共117例样本中,有效穿刺117 例,相符率100%,说明由甲状腺外科专业组医师进行术中穿刺检测的操作,成功率高,且试纸稳定。

2.2 特异度和敏感度

以冰冻病理结果为“金标准”,在Ⅵ区淋巴结清扫标本中常规寻找旁腺组织(图3),或将术中不能辨别的可疑组织行细针穿刺,若为甲状旁腺,则原位保留。

图3 在Ⅵ区淋巴结清扫标本中常规寻找旁腺组织

免疫胶体金试纸法判断甲状旁腺真阳性率(敏感度)为TP/(TP+FN)=74/76=97.4%;假阳性率(误诊率)为FP/(TN+FP)=0/41=0;真阴性率(特异度)为TN/(TN+FP)=41/41=100%;假阴性率(漏诊率)为FN/(TP+FN)=2/76=2.63%;准确率为115/117=98.3%(表1)。

表1 免疫胶体金PTH测试与病理诊断效度分析

2.3 甲状旁腺附近颈部不同组织内PTH表达

76 份病理证实的甲状旁腺,其中74 份PTH 值>65 pg/mL,范围62.1~1 340.6 pg/mL,两份PTH<65 pg/mL(均>60 pg/mL)。其余41例非甲状旁腺包括脂肪、淋巴结等PTH值均<65 pg/mL。甲状旁腺组织PTH值与甲状腺、脂肪、淋巴结的PTH 值均呈正态分布,采用配对t检验,甲状旁腺组织与其他任一组织相比较,PTH 值差异较大,差异均具有统计学意义(均P<0.001),甲状旁腺PTH值远高于其他3种组织(表2)。

表2 甲状旁腺组织与脂肪、淋巴结的PTH值比较

2.4 免疫胶体金试纸法和纳米碳法比较

试验组为74例,对照组1为50例,两组术前一般情况类似。术后第1天复查血钙及血PTH情况,对照组1的血钙及血PTH值略小于试验组,差异无统计学意义(P>0.05,表3)。

表3 试验组与对照组1 的术前、术后血钙、血PTH 指标差异 (±s)

表3 试验组与对照组1 的术前、术后血钙、血PTH 指标差异 (±s)

项目术前血钙(mmol/L)术前血PTH值(pg/mL)术后血钙(mmol/L)术后血PTH值(pg/mL)试验组2.309±0.119 45.400±11.406 2.073±0.167 35.767±13.159对照组1 2.307±0.116 43.565±12.605 2.043±0.167 34.570±11.620 t 0.10 0.76 0.88 0.48 P 0.918 0.447 0.379 0.630

2.5 免疫胶体金试纸法与常规肉眼法比较

试验组为74例,对照组2为56例,两组术前一般情况基本类似。术后试验组血钙及血PTH明显高于对照组2(P<0.05),提示免疫胶体金试纸法术后血钙值及血PTH值高于常规肉眼法(表4)。

2.6 免疫胶体金试纸法与纳米碳法低钙反应发生率的比较

在试验组与对照组1 中,试验组74 例患者中发生低钙反应4例,发生率5.4%,均为口周或四肢麻木,未出现抽搐或喉膈肌痉挛等严重症状;对照组1的50例患者中发生低钙反应4 例,发生率8.0%,同样为口周或四肢麻木,未出现更严重反应(Fisher精确检验,P=1.00,P>0.05)。

2.7 免疫胶体金试纸法与常规肉眼法低钙反应发生率的比较

在试验组与对照组2 中,试验组74 例患者中发生低钙反应4例,发生率5.4%,均为口周或四肢麻木,未出现抽搐或喉膈肌痉挛等严重症状;而对照组2的56 例中8 例(14.3%)发生低钙反应,其中7 例为口周或四肢麻木,1 例出现手部抽搐,未出现喉膈肌痉挛等严重症状(Fisher精确检验,P=0.202,P>0.05)。

术后低钙血症患者均行相应补钙处理,用药后症状缓解。出院后仍存在低钙血症者,继续口服钙剂,1 个月后复查血清PTH、血钙。全部出现低钙血症反应患者均恢复正常,考虑均为暂时性甲状旁腺功能减退造成的一过性低钙反应。所有患者均未出现永久性低钙血症。

2.8 费用时间比较

免疫胶体金试纸法费用仅40元,远低于纳米碳试剂及术中冰冻病理价格,且术中耗时短,准确性高。

3 讨论

2018年美国甲状腺学会关于成人患者术后甲状旁腺功能减退症的诊断、预防及管理声明[3]指出,双侧(同期或分期)甲状腺切除术最易导致术后低钙血症,且随着手术范围越大,手术时间越长,越易损伤甲状旁腺[5],通常是由于手术误切或超声刀、电刀等热、电损伤以及甲状旁腺的动脉血供及静脉引流被阻断。由于甲状旁腺小,位置及枚数变异大,且颜色、形态与周围淋巴结或脂肪近似,因此甲状腺切除手术中意外切除或损伤甲状旁腺,使其功能减退并不少见。有报道[6]全甲状腺切除术后暂时性甲状旁腺功能减退发生率约20%~30%,永久性甲状旁腺功能减退发生率约1%~7%,暂时性甲状旁腺功能低下会造成一过性低钙症状,对患者生存质量的影响较短暂;但永久性甲状旁腺功能低下会造成永久性低钙症状,出现手足麻木和四肢抽搐,病情严重时可伴有喉肌和膈肌痉挛,引起窒息死亡,严重影响患者生存质量,成为医疗纠纷的主要因素[7]。而目前暂无甲状旁腺激素替代疗法,仅依靠服用钙剂和维生素D暂时缓解症状,而长期服用会导致高钙血症、肾功能不全、基底核钙质沉积和神经精神系统异常等并发症,危害患者健康[8-9]。因此,提高术中识别率并保留甲状旁腺是目前临床医生的重大挑战。

纳米碳是目前临床应用最广泛的甲状旁腺负显影技术,其具有较强的淋巴趋向性、快速示踪、高度黑染率、时间持续长、与周围组织色彩对比度高等特点[10]。Gu 等[11]研究表明,注射纳米碳混悬液的患者术后血钙浓度较未注射者明显升高,且术后暂时性甲状旁腺功能减退者有所下降。同样有研究[12]认为纳米碳费用较高,操作不当易污染术区视野,且未明显减少术后低钙血症发生。近红外荧光显像技术既可以标记甲状旁腺并可追溯其血供,但目前在试验阶段,需进一步证实和论证。对于伽马射线探头识别、放大显微镜下操作或接触式内镜、光学相干断层成像术(optical coherence tomography,OCT)等方法各有优势。伽马射线探头识别目前成功经验少,临床医师放射线防护等问题需进一步解决。放大镜、内镜等器械设备要求高,依旧是基于解剖基础上的辨识,但对增强辨识作用有积极效果。而OCT 鉴别甲状旁腺由于探头尺寸及消毒方式限制,暂时仅用于试验室离体组织中。目前,依旧不可避免因特殊解剖位置使得甲状旁腺意外切除和血供破坏。综上所述,寻找一种操作简单、经济、高效、损伤小的术中辨认甲状旁腺方法尤为重要。

表4 试验组与对照组2术前、术后血钙、血PTH指标差异(±s)

表4 试验组与对照组2术前、术后血钙、血PTH指标差异(±s)

项目术前血钙(mmol/L)术前血PTH值(pg/mL)术后血钙(mmol/L)术后血PTH值(pg/mL)试验组2.309±0.119 45.400±11.406 2.073±0.167 35.767±13.159对照组2 2.289±0.129 43.753±11.647 1.982±0.234 26.145±11.515 t 0.82 0.72 2.27 3.94 P 0.411 0.470 0.025 0.001

黄海燕等[13]率先运用细针穿刺组织测定甲状旁腺,研究发现甲状旁腺组织与非甲状旁腺组织穿刺洗脱液PTH呈显著性差异。樊菁等[14]进行术中PTH快速检测,选择11例初诊甲状腺癌患者纳入研究,术中遇到可疑甲状旁腺时,首先由主刀医生按照经验主观判断,判断为甲状旁腺或非甲状旁腺,进行记录,对可疑甲状旁腺进行PTH快速检测,并取少量组织行术中冰冻。以冰冻病理结果为金标准对比医师肉眼判断及术中PTH。结果发现,肉眼经验性判断准确性为60%,敏感度为100%,特异度为11.1%,而术中PTH 快速检测准确性为85%,敏感度为100%,特异度为66.7%,提示术中快速测定PTH可有效提高甲状旁腺鉴别准确性与特异度,有助于甲状旁腺保护及原位保留。张进军等[15]选取106 例甲状腺腺叶切除术患者,随机分为常规肉眼组及PTH检测组,常规肉眼组总符合率为74.1%,而PTH 法为96.2%,常规肉眼组暂时性甲状旁腺功能减退发生率为11.3%,而PTH组为5.7%。两组术后永久性甲状旁腺功能减退发生率为3.8%和0。提示PTH 检测法甲状旁腺识别率高,可能会提高临床甲状旁腺发现率并降低相关甲状旁腺功能减退发生率,但仍需大样本研究进一步验正。戴佳奇等[16]则将快速检测PTH法(试验组)与纳米碳(对照组)法行对照研究,比较术前、术后血钙、血磷、PTH 等。在良性病例中,试验组术后血钙、血PTH稍高于对照组,但差异无统计学意义;在恶性病例中,试验组术后血钙稍高于对照组,血PTH明显高于对照组,差异有统计学意义。由此得出结论,术中使用快速检测PTH法,有助于判别甲状旁腺组织,尽可能避免误伤或误切甲状旁腺,减少术后低钙血症发生率。

本研究采用免疫胶体金试纸法在术中快速检测PTH,共117 组数据,成功率达100%,说明本研究术中穿刺检测操作简单易行,成功率稳定。与术中快速病理对比后发现特异度为100%,敏感度为94.1%,准确率达97.4%,可快速、有效的识别甲状旁腺组织。在76枚行冰冻病理证实为甲状旁腺的组织中,11枚为原位甲状旁腺血供较差,考虑存活可能性小,行甲状旁腺自体移植;14枚为在Ⅵ区淋巴结清扫后,从清扫物中仔细寻找并辨认考虑为甲状旁腺后进行穿刺测试,14枚中有2枚PTH测试结果<65 ng/mL,为63.5 ng/mL以及62.1 ng/mL,但病理结果证实为甲状旁腺。造成该穿刺结果为假阴性原因分析为:清扫物中分离出甲状旁腺腺体较少,细针穿刺时穿破腺体,导致穿刺物较少。余41 例组织,分别为淋巴结26 例,脂肪10例,甲状腺组织5 例,PTH 值均<65 pg/mL。对照组2为常规肉眼组,按该术式方式,仅对无法原位保留的疑似甲状旁腺行冰冻病理检测,证实为甲状旁腺组织后行自体移植,将甲状旁腺用小刀或组织剪剪成<1 mm 的薄片或碎粒种植于顿性分离后胸锁乳突肌内。剩余51枚甲状旁腺原位保留。

现今纳米碳已是一种成熟可靠的甲状旁腺判断技术,本试验中免疫胶体金试纸法术后血钙及血PTH均值稍高于纳米碳法,但差异无统计学意义,由此可见免疫胶体金试纸法检测甲状旁腺同样安全可靠。纳米碳费用高,且操作不当易造成黑染,影响手术视野,而免疫胶体金试纸法操作简单,费用低,不但可用于检测原位保留的甲状旁腺,还可用于检测需自体移植的甲状旁腺验证。

本研究中3 组行甲状腺全切手术的病例中均未出现永久性甲状旁腺损伤等严重并发症,3组病例均出现低钙反应。考虑原因为虽然甲状旁腺原位保留,但由于手术牵拉、术中解剖、能量器械的使用,造成短时间的甲状旁腺供血不足。

术中对于需要进行自体移植的甲状旁腺,应取其少量组织行冰冻病理学检测证实。有报道[17]甲状旁腺组织离体30 min 后开始出现空泡变形、细胞核变形、细胞内线粒体肿胀等细胞失活表现。有研究[18]认为冰冻病理学检查会损失部分甲状旁腺组织,延长移植甲状旁腺时间,会使种植的甲状旁腺功能下降,而越早进行甲状旁腺自体移植,成活率越高。但冰冻病理一般时间为40 min,严重影响甲状旁腺活性,且冰冻需要一定量组织进行,而本研究所用方法约10 min,在缩短时间的同时,减少甲状旁腺损失。免疫胶体金试纸法价格仅为40元/次,低于纳米碳试剂及术中冰冻病理价格。

综上所述,常规肉眼法识别甲状旁腺虽无经济、时间成本,但需要术者具有丰富的经验,对于资历尚浅的年轻医师存在一定困难。纳米碳技术目前较为成熟,受较多国内外专家推崇,其可将淋巴结显影,从而较好保护甲状旁腺,减少甲状旁腺功能减退。从试验结果分析,其术后血钙及血PTH 与免疫胶体金法结果相似。但纳米碳费用高,且操作不当影响手术视野。

根据目前加速康复外科(enhanced recovery after surgery,ERAS)理念[19],术中应用免疫胶体金试纸正确识别甲状旁腺后,紧贴甲状腺固有背膜操作,精细化解剖,尽量达到原位保留,术后减少患者的生理及心理创伤应激,加速患者康复,并继续监测患者外周静脉血情况,及时补钙,可有效缩短住院时间、降低医疗费用及减轻社会家庭经济负担。

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