马天驰， 刘继辉， 任伊宾， 卢 利， 杨 柯

1.沈阳市口腔医院 正畸科，辽宁 沈阳 110001；2.中国科学院金属研究所，辽宁 沈阳 110016；3.中国医科大学附属口腔医院 口腔外科，辽宁 沈阳 110053

修复由外伤、肿瘤、畸形修复等导致的骨组织缺损是临床工作中面临的巨大问题[1]。常规修复分为自体移植修复和生物材料替代等，自体移植由于自体组织有限，移植操作难度大，手术费用高，且增加新的创伤，患者精神、经济负担较大[2-3]。随着材料学发展，生物材料替代是近年来兴起的一种修复方法。生物材料替代是利用金属或非金属材料替代缺失组织，这类材料需要有较高的生物相容性，以钛、钛合金较为常见。但钛、钛合金等价格高昂，加工不易，所以研发一种价格便宜、容易加工的材料是材料学的研究方向[4]。

传统的不锈钢合金含镍，易致畸、致敏。研制一种机械性能良好且不含镍的不锈钢极为重要。无镍不锈钢用氮和镁替代镍，即高氮钢，其拥有良好的抗腐蚀性、机械性能及生物相容性[5]。随着氮含量的增加，高氮钢的生物相容性增加。材料的亲水性对细胞在其表面粘附和生长起到关键作用。材料内的氮元素含量影响材料的亲水特性[6]。随着氮含量增加，高氮钢的生物相容性增加。冷变形的拉伸可改变材料表面亲水性[7]。骨髓基质干细胞广泛存在于机体内，由于最早于骨髓中得到分离，常被称为骨髓基质干细胞[8]。本研究利用大鼠骨髓基质干细胞探讨不同冷变形量的高氮不锈钢的生物相容性差异。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验材料为中国科学院金属研究所提供的不同冷变形量的高氮不锈钢，拉伸率分别为0、14%、34%、64%,分别设为A、B、C、D组。经高温固溶、切片、抛光，制作成10 mm×10 mm×1 mm的薄片，清洗消毒后备用。

1.2 研究方法

1.2.1 骨髓基质干细胞分离培养扩增 将4周龄的SD大鼠(雌雄不限)脱颈处死后，无菌分离双侧股骨，去除软组织，剪断骨端，10%胎牛血清的DMEM培养基10 ml冲洗骨髓腔。收集冲洗后液体，置于培养瓶中，2 d后首次换液，连续培养时，每隔4 d换液，每7 d传代。培养基：DMEM培养液+10%胎牛血清+双抗；培养条件37℃，湿度100%，5% CO2。传代比例为1∶6。连续扩增细胞备用。

1.2.2 高氮钢表面细胞培养及成骨诱导 将预先消毒处理好的不同冷变形比例的高氮钢片放入24孔板，每种冷变形比例的高氮钢片设3个复孔，将细胞悬液的浓度调整为1×104个/ml，以模仿人体的成骨微环境。在每个材料表面及空白孔内滴加1 ml细胞悬液。培养基:DMEM培养液+10%胎牛血清+双抗。培养条件：37℃，湿度100%,5% CO2。连续培养。

1.2.3 细胞粘附 将骨髓基质干细胞接种于不同冷变形比例的高氮钢片表面，12 h后轻轻去掉培养液，胰蛋白酶消化，细胞计数。将粘附细胞量除以种植细胞量以获得细胞在不同金属片表面的粘附率。

1.2.4 MTT实验 称取0.5 g MTT，溶于100 ml的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，针头滤器过滤除菌，置于4℃ 避光保存。在配制和保存的过程中，容器用铝箔纸包住。通过MTT实验对不同冷变形高氮钢表面粘附细胞活性进行检测，由于一部分粘附于金属材料表面的细胞已死亡，为精确确定金属表面活细胞的数目和细胞活力而进行MTT细胞活性检测。将在金属表面培养的第1、3、5 d的细胞按试剂盒的方法进行MTT检测。

1.2.5 观察材料表面细胞形态 在金属片接种细胞的第1、3、5天分别按组取出金属片，PBS冲洗，2.5%戊二醛固定，50%、75%、95%、100%乙醇梯度脱水，金相显微镜观察细胞数量和形态。

1.2.6 碱性磷酸酶检测实验 分别将种植于材料表面的细胞培养至第1、3、5天，取出用PBS轻轻冲洗3遍，在4℃环境下用0.01% TritonX-100裂解细胞12 h，然后用吸管反复吹打1 min，使细胞充分碎解。按照试剂盒的说明进行检测，碱性磷酸酶活性以每克蛋白中含有的金氏单位表示，结果以3次独立实验的平均值表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析。数据采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 材料表面细胞粘附率及细胞形态 A、B、C、D组高氮不锈钢表面细胞粘附率分别为88%、90%、93%、94%。随着冷变形率的提升，材料表面粘附的细胞数量提升，差异有统计学差异(P<0.05)。将基质干细胞种植于材料表面培养1、3、5 d后，在金相显微镜下观察细胞增殖情况及细胞形态发现，随着培养时间延长，细胞在材料表面生长良好并发生增殖。见图1～4。

2.2 MTT实验 比较第1天各组金属表面的细胞光密度值，差异无统计学意义(P>0.05)。第3、5天，随不同冷变形率高氮钢与细胞接触作用时间的延长，吸光度逐渐增大，细胞生长状态良好，各种冷变形率的高氮钢均对基质干细胞没有破坏和抑制生长作用,组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 金相显微镜下拉伸率为0的高氮钢表面骨髓基质干细胞培养情况(200倍，a.第1天；b.第3天；c.第5天)图2 金相显微镜下拉伸率为14%的高氮钢表面骨髓基质干细胞培养情况(200倍，a.第1天；b.第3天；c.第5天)图3 金相显微镜下拉伸率为34%的高氮钢表面骨髓基质干细胞培养情况(200倍，a.第1天；b.第3天；c.第5天)

图4 金相显微镜下拉伸率为64%的高氮钢表面骨髓基质干细胞培养情况(200倍，a.第1天；b.第3天；c.第5天)

表1 不同冷变形率的高氮钢MTT检测光密度值比较

注：与A组比较，①P<0.05；与B组比较，②P<0.05；与C组比较，③P<0.05

2.3 碱性磷酸酶活性检测 第1天，4种金属表面的细胞碱性磷酸酶活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在第3、5天时，随着冷变形率的增高，高氮钢表面的细胞碱性磷酸酶活性增高，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同冷变形率的高氮钢表面细胞碱性磷酸酶活性比较/U·g-1

注：与A组比较，①P<0.05；与B组比较，②P<0.05；与C组比较，③P<0.05

3 讨论

各种原因引起的骨缺损是临床常见的症状，由于骨缺损而引起的软组织塌陷和相关功能障碍是临床中的常见问题[9]。生物医用金属材料由于高硬度的力学性能及耐腐蚀性被广泛应用，以钛、钛合金及医用奥氏体不锈钢较为常见。奥氏体不锈钢含有镍，镍原子对细胞的直接损害及长期致畸作用已被证实。性能良好且不含镍的生物医用金属材料对骨缺损患者极为重要[10]。

生物医用金属材料植入骨组织的过程中，不可避免的会造成骨组织损伤[11]。早期机械性固位时，骨髓基质干细胞在骨修复开始时会从组织中游出，并向损伤处聚集，在各种生物因子的作用下，产生成骨性分化，首先分化为成骨前体细胞，最终变为骨细胞[12]。骨基质将植入材料和骨组织结合，最终完成生物性固位。在此过程中，处于正常骨组织和植入材料之间的基质干细胞的数量、活性、增殖性及成骨分化能力对于植入材料的后期稳定性和生物相容性起着重要作用[13]。本研究中，基质干细胞作为检测不同冷变形量的高氮钢的生物相容性的种子细胞，将其接种于不同冷变形量的高氮钢表面12 h后发现，随着冷变形量的增加，其细胞粘附率同时增加，这可能于冷变形量增大提高材料表面的亲水性有关。作为生物材料此结果意味着在材料植入机体后，初期冷变形量大的高氮钢周围可以聚集更多的基质干细胞。MTT检测法可有效区分细胞群中的活性细胞[14]。实验结果证明，随着冷变形量的增加，高氮钢表面的细胞活性随之增加。碱性磷酸酶活性可检测基质干细胞在材料表面的成骨能力，其结论为随着冷变形量的增加，高氮钢表面的细胞碱性磷酸酶活性随之增加[15]。同时，通过金相显微镜直观观察整个细胞培养过程中高冷变形量的高氮钢表面的细胞密度更高。

综上所述，随着冷变形率的提高，高氮钢的生物相容性提高。但加工冷变形会对高氮钢的力学性能产生影响，而植入材料不仅要具有良好的生物相容性，还需具有良好的机械性，今后仍需进一步研究。