常 艳， 童方念， 程茗慧， 张效林

北部战区总医院 心内科，辽宁 沈阳 110016

对氧磷酶(paraoxonase，PON)家族主要由PON1、PON2、PON3组成，PON1主要由肝合成并存于血浆中[1]。PON1与血清中高密度脂蛋白代谢的关系密切，PON1的遗传多态性改变与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生、发展存在相关性[2]。有研究发现，PON1血清学活性与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生呈负相关，PON1多与血清高密度脂蛋白结合，在血清中抑制低密度脂蛋白发生氧化反应，降低体内的氧化型低密度脂蛋白的表达水平，破坏氧化型低密度脂蛋白中有细胞毒性的溶血磷脂的活性，从而抵抗冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生，PON1血清学表达水平与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生呈正相关[3-4]。急性心肌梗死是冠状动脉粥样硬化不稳定斑块破裂继发冠状动脉内血栓，导致血栓梗塞相应的部位发生心肌坏死。有研究表明，PON1 rs662(Q192R)单核苷酸多态位点会改变PON的活性，与经皮冠状动脉介入术后氯吡格雷的低反应性和支架术后血栓的形成存在相关性[5-6]。目前，PON1活性改变是否与急性心肌梗死的发生存在相关性尚不明确，需要进一步证实[7-8]。本研究旨在探讨PON1基因单核苷酸多态性与急性心肌梗死发生的相关性。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2015年2月至2017年6月北部战区总医院收治的急性心肌梗死患者纳入A组，同时,选取同期因胸痛入院但冠状动脉造影为阴性的患者纳入B组，每组各326例。急性心肌梗死的诊断标准：心电图出现动态演变过程，至少两个肢体导联ST段抬高≥0.1 mV，或胸导联≥0.2 mV，或新发的左束支传导阻滞；心肌损伤标志物异常升高，超过正常参考值上限的99%；持续30 min以上的典型胸痛症状；血清心肌损伤标志物动态变化。排除标准：病毒性心肌炎、肝功能不全、脑卒中的急性期；服用糖皮质激素、类固醇类抗炎药或免疫抑制剂患者；肺部感染、发热；炎症性肠病、风湿性疾病、各类自身免疫性疾病；血液系统疾病、血液透析治疗的肾功能不全者；严重的心力衰竭、血流动力学不稳定者；造血系统疾病、恶性肿瘤。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 研究方法 DNA提取试剂盒(北京天根生物试剂有限公司生产)提取两组外周血的基因组DNA。两组均在空腹状态收集抽取外周静脉血5 ml，抗凝管(乙二胺四乙酸二钠)中静置5 min，-70℃下保存[9]。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增两组的基因组DNA。应用Primer 5.0软件获取PON1-108A/G单核苷酸多态片段的引物，上游引物： 5′-ATCAGCTTCGCCATGGTCGT-3′，下游引物：5′-CTCTCTTTACAGTTGGAAGG-3′。PCR扩增在25 μl反应体系中进行，其中基因组DNA 1 μl，10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTP 2.0 μl，上游和下游引物各10 pmol，rTaq酶3 U，去离子水加至25 μl。通过热循环仪完成PCR扩增反应(美国BIO-RAD公司)。热循环参数：95℃预变性3 min；以94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s的顺序反应35个循环；72℃延伸7 min；PCR片段长度为265 bp。吸取PCR产物5 μl，加入6倍稀释的电泳上样缓冲液，2%琼脂糖凝胶下电泳，电压设定100 V，电泳时间45 min。对PCR扩增的检测样品进行测序检样(上海生物工程技术有限公司)。

2 结果

2.1 两组患者的一般资料比较 A组吸烟、高血压患者的比例明显高于B组，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。A组血清中低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)的表达水平明显高于B组，而血清高密度脂蛋白(high-density lipoproteincholesterol，HDL-C)的表达明显低于B组，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者的临床资料比较

2.2 基因型分析 PON1-108A/G单核苷酸多态位点存在3种基因型，分别为AA型、AG型和GG型，PON1-108A/G片段PCR扩增片段大小为265 bp。PON1基因-108A/G单核苷酸多态位点的等位基因频率和基因型分布频率符合Hardy-Weinberg平衡定律。PON1-108A/G单核苷酸位点的3种基因型AA型、AG型和GG型在A组的分布频率为34.0%、42.9%和23.1%，在B组的分布频率分别为27.0%、43.6%和29.4%；PON1基因-108A/G单核苷酸多态位点A和G等位基因在A组的分布频率为55.5%和44.5%，在B组的分布频率为51.2%和48.8%(P=0.01；比值比=1.31；95%可信区间为1.05～1.63)。Logistic多元回归分析结果显示，PON1基因-108A/G单核苷酸多态G等位基因是急性心肌梗死发病的危险因素。

3 讨论

急性心肌梗死是在冠状动脉粥样硬化病变的基础上，冠状动脉血管壁的炎症负荷、脂质负荷持续加重，冠状动脉粥样硬化不稳定型斑块破裂，继发了冠状动脉不稳定斑块内炎性因子的激活，引起血液中的血小板及纤维蛋白原活化，继发冠状动脉血管内血栓形成，冠状动脉粥样硬化不稳定斑块的破裂，释放相应的斑块内容物[1-2]。PON1通过对抗氧化应激反应以防止冠状动脉内巨噬细胞吞噬脂肪颗粒，遏制动脉粥样硬化反应速度[10]。本研究结果显示，两组在PON1基因-108 A/G单核苷酸多态位点GG等位基因分布频率方面比较，差异有统计学意义(P<0.05)，G等位基因可作为预测急性心肌梗死发生的危险因素。PON1基因-108A/G单核苷酸多态位于PON1基因启动子区域的-108位点，其核苷酸位点由A到G改变，引起PON1基因启动子区域转录因子结合位点的改变，从而引起PON1蛋白表达翻译水平的变化。在冠状动脉粥样硬化不稳定斑块破裂的过程中，冠状动脉血管壁氧化应激反应加重，使冠状动脉粥样硬化不稳定斑块的炎性反应加重，造成冠状动脉粥样斑块的破裂和出血，继发冠状动脉内血栓的形成[1]。本研究为回顾性分析，尚不能对其因果关系给予充分的肯定。

综上所述，PON1-108 A/G单核苷酸多态位于基因启动子区-108位点，该碱基位置A变成G可能导致转录因子与基因的结合位点发生变化[9]，PON1-108A/G等位基因可能是急性心肌梗死发病的危险因素，PON1-108A/G等位基因的改变对动脉粥样硬化不稳定斑块的形成具有重要影响。