,,宏达,,*,,,

(1.东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030; 2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030; 3.黑龙江飞鹤乳业有限公司,黑龙江哈尔滨 150030; 4.黑龙江完达山林海液奶有限公司,黑龙江牡丹江 157100)

母乳喂养是为新生儿提供营养最合适的方式。母乳脂肪酸不仅为婴儿各种生理活动提供全面营养,而且还能够提供一些婴儿不能自身合成但所必需的多种脂肪酸,以保证婴儿在出生半年内免受多种病原菌的侵扰。牛乳和山羊乳是迄今为止应用最多的母乳替代品,一是因为牛羊乳的脂肪含量与人乳接近,二是因为其有绝对的资源优势。乳中脂肪酸的构成主要受环境因素和内在因素的影响,环境因素包括饮食、季节、气候等,内在因素包括品种、胎次、泌乳阶段等[1]。如消耗含有高浓度n-3长链多不饱和脂肪酸(LCP)的鱼类或摄取来自藻类单细胞油[2]的妇女,其乳汁中二十二碳六稀酸(DHA)水平相对较高[3]。

20世纪80年代开始,各国陆续报道了乳中脂肪酸组成的重要研究成果。Yuhas等[4]分析了9个国家的人乳脂肪酸组成中DHA的变化,发现饱和脂肪酸(SFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)的比例在很多国家都相对稳定,而一些多不饱和脂肪酸(PUFA),特别是DHA含量是高度可变的;张耀广等[5]采用GC-MS法测定了生鲜牛乳脂肪酸组成,测得17种脂肪酸,以SFA为主,含量为62.43%;凌育赵[6]采用气相色谱法分析了羊乳中脂肪酸的成分,确定了主要脂肪酸组成为棕榈酸22.32%,油酸23.78%等,SFA∶UFA(不饱和脂肪酸)=1.39∶1。虽然对母乳、牛乳和羊乳脂肪酸组成的研究成果层出不穷,但有关母乳、牛乳及山羊乳脂肪酸组成的系统对比研究信息非常有限。

因此,本研究选取代表东北地区饮食结构及地理位置的吉林省松原市进行母乳样本采集,应用气相色谱-质谱分析方法,对母乳、牛乳及山羊乳脂肪酸进行系统分析,深入了解其脂肪酸组成差异,对研制出更接近天然母乳的婴幼儿配方奶粉的脂质基料、开发母乳化奶粉及提高婴幼儿健康体质提供指导,为更深入研究中国母乳脂质组学提供一定的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

母乳 选择在吉林省松原市妇幼保健院分娩的健康、不吸烟的哺乳期母亲50人(分娩1～7 d母亲15人,7～14 d母亲15人,>14 d母亲20人),年龄在24～40岁,平均年龄29±5岁,所有母亲均按照正常的饮食;牛乳 选取哈尔滨市综合牧场健康的荷斯坦黑白花奶牛20头,平均胎次为第3胎,平均年龄5±1岁;山羊乳 选取哈尔滨华阁乳业纯种奶山羊20头,平均胎次为第3胎,平均年龄6±1岁。

3K15台式冷冻离心机 德国Sigma,深圳市万宏源贸易有限公司;PS-60AL超声波清洗器 深圳市深华泰实业有限公司;68523气相色谱-质谱联用仪 安捷伦科技有限公司;N100氮吹仪 上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳样的采集 母乳采集:在吉林省松原市根据具体的采样方案采集15个初乳(1～7 d)、15个过渡乳(7～14 d)、20个成熟乳(>14 d),采集量为50～80 mL。乳样采集前,对乳晕及四周进行消毒,用自动吸奶器采样,采集后的样品于-20 ℃冷冻保存,用气相色谱-质谱法(GC-MS)对母乳三个泌乳期脂肪酸成分进行分析,确定不同泌乳期母乳脂肪酸种类和相对含量。

牛羊乳采集:在东北地区经由专业养殖人员根据具体采样方案进行常乳采集。采集的乳样置于250 mL消毒过的取样瓶中,并分装到50 mL离心管中,将样品置于-20 ℃的冷冻箱中,对牛羊乳脂肪酸组成和含量进行测定,并与成熟期母乳脂肪酸组成进行差异分析。

1.2.2 脂肪的提取 参考Folch等[7]的方法,提取乳中的脂肪。取乳样5 mL,加入甲醇10 mL、氯仿5 mL、蒸馏水1.3 mL,25 ℃充分振荡大约30 min;再加入氯仿5 mL和2%的Na2SO45 mL,25 ℃振荡15 min后8000 r/min冷冻离心30 min;取离心后的下层溶液,过滤(在滤纸中加入2 g无水硫酸钠);向离心所得上层溶液中加入10 mL氯仿,混匀后再次离心30 min;重复上一步,充分混匀两次所得的滤液,用氮气吹干,即为乳脂肪,放-20 ℃冰箱中备用。

1.2.3 脂肪的甲酯化 参考Kelly等[8]、王存芳等[9]的方法,采用碱催化法对乳脂肪进行前处理。取乳脂肪0.15 g,加入5 mL正己烷,25 ℃超声(功率360 W)3～5 min至乳脂肪溶解,然后加入5 mL CH3OH、5 mL KOH-CH3OH溶液(0.5 mol/L),25 ℃超声(功率360 W)1 min后55 ℃水浴加热20 min,加入5 mL正己烷、5 mL饱和氯化钠溶液,静置,取200 μL上层有机相,并用4 mL正己烷稀释,过0.22 μm有机相滤膜,取1 μL准备上样,每个乳样做三个平行试验。

1.2.4 色谱条件 色谱柱为HP-5MS(5% Phenyl Methyl Silox)弹性石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm),氦气流速为0.8 mL/min。色谱柱起始柱温为40 ℃(保持2 min),首先以8 ℃/min升到200 ℃,然后以3 ℃/min升到215 ℃,最后以10 ℃/min升到230 ℃,保持7 min,以10 ℃/min升到280 ℃,保持2 min。进样量为10 μL,分流比为30∶1。260 ℃作为进样口温度,280 ℃作为检测器温度。

1.2.5 质谱条件 离子源:EI;离子源温度:230 ℃,扫描范围为33～450 amu;能量:70 eV。用Xcalibur软件处理数据,未知化合物要与计算机检索NIST谱库(107k compounds)相匹配,仅当正反匹配度均大于80的鉴定结果才予以报道。

1.3 数据处理

试验所得数据应用Excel、SPSS软件计算平均值、方差和差异性分析,应用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 母乳不同泌乳期脂肪酸组成分析

2.1.1 母乳不同泌乳期SFA、MUFA、PUFA组成分析 母乳中共测得12种SFA,7种MUFA,13种PUFA,共32种,比陈爱菊等[10]测得的总脂肪酸种类多5种。脂肪酸碳原子数目在6～22之间,且多为偶数碳原子脂肪酸。表1显示松原地区母乳中脂肪酸的构成和各种脂肪酸相对含量随泌乳期的变化。其中含量最高的是油酸(C18∶1n-9),其次为棕榈酸(C16∶0),亚油酸(C18∶2n-6),共占母乳中总脂肪酸含量的75%左右。

母乳中MUFA和PUFA是影响脂肪酸组成和分布的重要因素,从表1可以看出,SFA中棕榈酸(C16∶0)最丰富,其相对含量在初乳阶段最高,占总脂肪酸含量的22.62%。MUFA中含量最丰富的是油酸(C18∶1n-9),初乳含量为32.27%、过渡乳32.12%、成熟乳30.53%,但初乳中油酸含量显著低于重庆地区,原因可能在于重庆居民膳食中摄入了更多的菜籽油[10]。

表1 不同泌乳期母乳脂肪酸组成(%总脂肪酸)Table 1 The fatty acid contents of breast milk at different lactation(% of total fatty acid)

母乳中PUFA主要包括亚油酸(LA)、α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(AA)等。其中,含量最高的是LA,在成熟乳中可达21.73%,其次为ALA,从初乳到成熟乳,含量呈上升趋势,成熟乳期含量最高为1.66%,过渡乳为1.62%,初乳为1.24%。DHA含量从初乳期0.57%增加到过渡乳期0.54%,又显著降低至成熟乳期的0.35%(p<0.05)。其含量比呼和浩特、长春、重庆地区高,但显著低于上海、广州地区[10],同时Yuhas等[4]通过对9个国家的人乳脂肪酸比较发现,DHA含量变化最大,说明DHA受地域及饮食的影响非常大。母乳中PUFA相对含量在三个泌乳期并无显著变化(p>0.05),Barreiro等[12]也得到了相同的结论。

母乳中SFA、MUFA、PUFA在三个泌乳期的变化如图1所示,从图1可以看出,母乳中SFA含量随着泌乳期呈上升趋势,初乳SFA含量为36.16%,过渡乳37.89%,成熟乳38.10%。此趋势与呼和浩特市的母乳SFA含量变化趋势有一致性[11],但上海、广州和重庆等地区SFA含量在成熟乳期显著低于初乳期(p<0.05)[10],这可能是由于南北方地区的饮食习惯不同造成的。母乳中MUFA相对含量随着泌乳期的延长并没有出现显著性差异(p>0.05)。母乳中PUFA含量随着泌乳期的延长呈现先下降后上升的趋势,但无显著性差异(p>0.05)。初乳、过渡乳和成熟乳PUFA含量分别为27.95%、26.24%、27.00%。

图1 母乳总脂肪酸含量随泌乳期的变化Fig.1 Content changes of total fatty acids in breast milk注:同一指标间不同字母表示存在 显著性差异(p<0.05),图2～图4同。

2.1.2 母乳不同泌乳期中链脂肪酸(MCFA)和长链脂肪酸(LCFA)组成分析 母乳脂肪酸碳链的长短是影响婴儿消化吸收的重要因素,MCFA在新生儿和婴儿喂养中有重要的营养与免疫作用,而且更容易被消化吸收。目前,很少有针对MCFA和LCFA进行的系统研究。MCFA被认为是唯一可用于有效治疗如下三种疾病的物质:α-脂蛋白血症、小肠淋巴管扩张症、乳糜性瘘管[13]。

图2显示,母乳中MCFA含量在1～2周期间显著升高(p<0.05),由初乳的2.45%显著升高到过渡乳的5.88%,成熟乳中MCFA含量为5.40%,与过渡乳相比没有显著性差异(p>0.05)。母乳中LCFA相对含量随着泌乳期的延长呈现先下降后上升的趋势(图2),初乳33.71%,过渡乳32.01%,成熟乳32.7%,整个泌乳期LCFA含量没有显著性差异(p>0.05)。

图2 母乳中、长链脂肪酸随泌乳期的变化Fig.2 Content changes of MCFA、LCFA in breast milk

2.2 母乳、牛乳及山羊乳脂肪酸组成差异分析

2.2.1 母乳、牛乳及山羊乳SFA、MUFA、PUFA组成分析 母乳及牛羊乳中都含有丰富的脂肪酸,其中90%以上是偶数碳脂肪酸,特别是乳中的PUFA和MCFA,十分有益于人体健康。

从表2可以看出,母乳、牛乳及山羊乳中脂肪酸种类均在30种左右,非常丰富。母乳中主体脂肪酸是油酸(C18∶1n-9)(30.53%)、亚油酸(C18∶2n-6)(21.73%)、棕榈酸(C16∶0)(21.08%),共占母乳中总脂肪酸含量的75%左右。牛乳中主体脂肪酸是油酸(C18∶1n-9)(25.12%)、棕榈酸(C16∶0)(18.16%)、硬脂酸(C18∶0)(15.48%)、豆蔻酸(C14∶0)(10.64%)、棕榈油酸(C16∶1n-7)(6.22%)等,其含量占总脂肪酸的70%以上。山羊乳中主体脂肪酸为油酸(C18∶1n-9)(20.79%)、棕榈酸(C16∶0)(18.08%)、癸酸(C10∶0)(9.12%)、硬脂酸(C18∶0)(8.45%)、二十三碳酸(C23∶0)(8.13%)。侯建平[14]对41个奶粉样本中脂肪酸测定发现油酸的范围为22.19%～54.41%,范围广泛,相对于牛乳而言山羊乳中油酸含量与其范围更为接近,但与母乳中含量仍有很大差距。羊乳中低级脂肪酸C2∶0～C10∶0的含量较高,其中辛酸(C8∶0)、癸酸(C10∶0)是羊乳的特征脂肪酸,两种脂肪酸总含量为13.8%。同时这两种特征脂肪酸都具有抗病毒的生物活性,陈银基等[15]已经通过实验得到了证实。

从表2可以看出,母乳与牛羊乳在脂肪酸组成上有很大的不同,如存在于牛羊乳中的丁酸(C4∶0)和己酸(C6∶0),在母乳中含量极少,几乎检测不出。母乳喂养婴儿10%～12%的能量来源于棕榈酸(C16∶0),其含量在母乳中可达21.08%,而在山羊乳中含量为18.08%,存在显著差异(p<0.05)。这种因物种、环境和饮食所造成的差别是必然的,这也是牛羊乳作为婴儿配方奶粉基料存在的缺陷。

表2 母乳、牛乳及山羊乳脂肪酸的相对含量(%总脂肪酸)Table 2 The relative content of fatty acids in the breast milk/bovine milk/goat milk(% of total fatty acid)

母乳PUFA中含量最为丰富的是LA、AA和DHA。母乳中LA和AA含量显著高于牛羊乳(p<0.05),母乳中LA含量可达21.73%,其次为羊乳,4.43%,牛乳中含量最少,为2.19%。母乳中AA含量0.66%,牛羊乳分别为0.24%、0.15%。母乳中DHA含量为0.35%,牛羊乳分别为0.25%、0.13%。其中LA是一种必须脂肪酸,可以降低血液中胆固醇含量。LA和ALA是合成AA和DHA的前体,对婴儿智力与视力的发育具有重要作用。同时DHA能促进婴儿视网膜的成熟和视觉皮层的发育。因此,丰富的DHA能提高视觉灵敏度,促进婴儿的大脑发育。

许多研究[16]指出,乳中n-6和n-3 LCP可以促进婴儿脑正常发育,特别是在早期生活中有极其重要的作用。同时这些LCP对于神经系统的发育是重要的,并且在发育中的大脑和视网膜中大量累积[17-18]。但LCP中的AA和DHA天然存在于乳中,在目前的婴儿配方食品中通常不存在。这种脂肪酸组织水平较低,导致食用配方食品的早产儿视网膜功能降低、视力下降、DHA红细胞水平较低[3]。婴儿组织中LCP的组成主要取决于乳中LCP的含量,这反过来又部分反映了孕妇饮食中的脂肪酸组成[19]。因此在婴儿配方食品中,应该加强LCP的添加,以提高婴儿的视力水平,促进婴儿中枢神经的生长发育。

由图3可以看出,山羊乳中SFA含量最高,为69.07%,其次为牛乳63.49%,母乳中含量最低,为38.10%。母乳中MUFA含量最高,为34.89%,其次为牛乳,含量为33.15%,羊乳中含量最少,为24.71%,三者有显著差异(p<0.05);母乳中PUFA含量最高,为27.00%,牛羊乳中含量较低,羊乳为6.20%,牛乳为3.32%。这就要求在婴儿配方食品中,应注意PUFA的强化。

图3 母乳、牛乳及山羊乳总脂肪酸平均含量Fig.3 The content of fatty acids in the breast milk,bovine milk,goat milk

凌育赵[6]通过对羊乳中脂肪酸的组成进行测定发现,SFA和UFA之比为1.39∶1。本研究发现羊乳中SFA∶UFA=2.23∶1,与凌育赵的测定结果存在差异,可能是由于山羊所处的环境和喂养方式不同所造成的。结合表2可以看出,牛乳中SFA含量是母乳的1.66倍,其中辛酸(C8∶0)、二十四碳酸(C24∶0)、豆蔻酸(C14∶0)和硬脂酸(C18∶0)的含量都显著高于母乳(p<0.05),但棕榈酸(C16∶0)含量显著低于母乳(p<0.05)。

2.2.2 母乳、牛乳及山羊乳MCFA和LCFA组成分析 母乳及牛羊乳中MCFA和LCFA含量如图4所示,从图4可以看出,山羊乳中MCFA含量最高,为20.21%,其次为牛乳(11.89%),比羊乳少了8.32%,这也是羊乳比牛乳更容易被人体代谢吸收的原因。结合表2可以看出,山羊乳MCFA中含量最高的是癸酸(C10∶0),占总脂肪酸含量的9.12%,显著高于牛乳(2.54%)和母乳(1.12%)(p<0.05);但是山羊乳中月桂酸(C12∶0)含量比母乳及牛乳低,含量依次为牛乳4.39%>母乳4.08%>山羊乳3.48%。羊乳中碳十二以下的中、短链低级挥发性脂肪酸如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸等,可以抑制胆固醇沉积,降低血清胆固醇水平,控制体重,预防和治疗胆结石以及肠道功能性疾病[20-21],还能够增加肠道免疫功能,增加胃肠蠕动,改善结肠微循环,延缓婴儿胃肠排空时间,对结肠粘膜产生营养作用,且对回肠末端微循环也有一定影响[22]。这充分说明了羊乳的营养价值比牛乳更高,这一结论与陆东林等[23]、葛武鹏等[24]得出的结论一致。

图4 母乳、牛乳及山羊乳中中、长链脂肪酸含量Fig.4 The content of MCFA,LCFA in the breast milk,bovine milk,goat milk

通过图4所示,3种乳中LCFA占总脂肪酸平均含量存在显著性差异(p<0.05),牛乳50.30%>山羊乳48.04%>母乳32.70%。结合表2可以看出,LCFA中,二十四碳酸(C24∶0)含量在牛乳中比在母乳及山羊乳高,其含量分别为牛乳0.16%>山羊乳0.12%>母乳0.08%。硬脂酸(C18∶0)含量在牛乳中最高,为15.48%,母乳含量为6.45%,山羊乳为8.45%。硬脂酸容易在小肠中形成皂化物,不易被消化吸收,与之相比MCFA和UFA更容易被消化吸收,所以从硬脂酸含量方面而言,羊乳产品脂肪酸质量更优于牛乳,更益于婴幼儿的肠道健康。

3 结论

本研究结果显示,不同泌乳期母乳脂肪酸种类不变,含量存在一定的差异。母乳中SFA含量随着泌乳期呈上升趋势,初乳SFA含量为36.16%,过渡乳37.89%,成熟乳38.10%。MUFA和PUFA含量随着泌乳期的延长没有显著性差异(p>0.05)。母乳、牛乳及山羊乳脂肪酸组成和相对含量存在显著差异(p<0.05),牛乳和山羊乳主要以SFA为主,山羊乳中SFA含量最高,为69.07%,是牛乳的1.08倍。辛酸(C8∶0)、癸酸(C10∶0)是羊乳的特征脂肪酸,其含量分别为4.68%,9.12%,显著高于牛乳(p<0.05)。棕榈酸(C16∶0)作为母乳喂养婴儿的主要能量来源,其含量达21.08%,牛乳含量为18.16%,山羊乳含量为18.08%。主要功能性脂肪酸LA、ALA、AA和DHA,在母乳中的含量明显高于牛羊乳,其中母乳中LA含量为21.73%,是牛乳的9.9倍,山羊乳的4.9倍,差异显著(p<0.05)。从脂肪酸组成来看,山羊乳脂肪酸组成和比例更接近母乳。通过对不同种类乳中脂肪酸进行比较分析,为婴幼儿配方粉的母乳化研究提供一定的理论基础。