莫文法， 张锡流

1桂林医学院附属医院病理科(广西桂林 541001)； 2广西中医药大学第一附属医院病理科(广西南宁 530023)

鼻咽癌是鼻咽部上皮组织发生的恶性肿瘤,是我国高发恶性肿瘤之一，多见于我国广东、广西、福建等南方地区，有明显的地域性，男性患者多于女性患者，发病率为耳鼻喉头颈部恶性肿瘤之首。鼻咽癌有易浸润性、高转移性和易复发的临床特点，但鼻咽癌的病因及发生机制目前尚未完全明确。2005年Glinsky等[1]通过mRNA微集阵列(microarray)技术，发现并总结了包括泛素特异性肽酶22基因(ubiquitin specific peptidase 22，USP22)等11个基因在内的一组癌死亡标签(death-from-cancer signature)。癌死亡标签在多数肿瘤细胞中高度表达，编码促使肿瘤生长的蛋白质，与肿瘤的发生发展、转移、耐药性和预后复发等密切相关，因此，也被认为是肿瘤细胞的标记基因[2]。USP22是肿瘤干细胞标志家族中一个成员，属于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用。目前已经发现USP22在人类肺癌、肾癌、肠癌、胃癌、甲状腺癌等多种肿瘤中高表达[3-7]。国内对USP22在鼻咽癌方面的报道罕见，故本研究采用免疫组织化学方法检测USP22在鼻咽癌组织中的表达, 并初步分析USP22蛋白的表达与患者临床病理因素和预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集随访资料完整的2013年1月至2014年12月桂林医学院附属医院病理科存档的60例鼻咽癌组织标本作为实验组。其中非角化性癌57例，角化性鳞状细胞癌3例；男46例，女14例；有淋巴结转移50例，未发现淋巴结转移10例；年龄32～80岁，中位年龄50岁。另随机收集同期20例鼻咽黏膜慢性炎组织标本作为对照组，其中男11例，女9例，年龄18～68岁，中位年龄37岁。所选标本均为手术前未接受过任何相关放疗或化疗治疗的标本。

1.2 试剂 兔抗人USP22多克隆抗体购自Abcam公司，货号ab71732；即用型快捷免疫组化MaxVision试剂盒、DAB显色试剂盒和抗原修复液等试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 临床随访 尽可能对2013—2014年期间在我院就诊和治疗的每例鼻咽癌患者进行随访，随访方式主要通过电话、患者再次到门诊诊查或再次住院治疗资料的方式进行。每次随访做好记录，第1年半年随访1次，第2～3年每3个月随访1次，第3年以后每月随访1次，记录患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)，以病理确诊日期作为观察起点，随访至2017年12月。最后选取资料完整的60例鼻咽癌患者的石蜡保存标本作为研究对象。

1.3.2 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学MaxVision法进行染色,所有实验操作步骤均按说明书严格进行。主要步骤：3～4 μm厚切片，恒温箱60℃烤片2 h以上，二甲苯脱蜡，梯度酒精和自来水水化，高温高压修复(pH=9.0的EDTA抗原修复液)，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗，滴加USP22(1∶200稀释)一抗，室温下孵育60 min，PBS缓冲液冲洗，滴加二抗，室温下孵育15 min，PBS缓冲液冲洗3次，DAB显色；苏木素复染，脱水，封片等。用已知的阳性的乳腺癌切片作为阳性对照, 用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3.3 免疫组化结果判定 结果判定参照其他学者[7-9]免疫组化二级记分法判定：阳性细胞数比例：≤5%为0分，6%～25% 1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度分类：无色为0分,淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据切片中阳性细胞数比例和细胞着色强度，两种评分的乘积进行判定，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，大于4分为强阳性(+++)，统计学处理时将分级≥1分归为阳性。以上结果由至少2位病理科医师在双盲情况下观察确定。

2 结果

2.1 USP22的表达 USP22阳性染色部位为细胞质，阳性染色可见细胞胞质呈棕黄色，见图1。USP22蛋白在鼻咽癌组织中的阳性表达率明显高于在鼻咽部黏膜慢性炎组织的表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

A：USP22在鼻咽黏膜慢性炎性组织中的表达(×200)；B：USP22在鼻咽癌组织中的阴性表达(×200)；C：USP22在鼻咽癌组织中的阳性表达(×200)；D：USP22在鼻咽癌组织中的阳性表达(×400)

图1 两种组织中USP22的表达(MaxVision)表1 两组标本组织中USP22蛋白的阳性表达 例

2.2 USP22的表达与鼻咽癌临床病理参数之间的关系 USP22阳性表达率与淋巴结转移有显著的相关性(P<0.05), 而与患者性别、年龄、病理分型等临床病理特征无明显相关性(P>0.05)，见表2。

2.3 USP22蛋白和患者预后的关系 本研究发现在鼻咽癌组织中，USP22阳性表达患者的3年OS、PFS均明显低于USP22阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 USP22的表达与 NPC临床病理参数之间的关系 例

表3 鼻咽癌组织中USP22蛋白表达与患者预后的关系 例(%)

3 讨论

3.1 USP22在鼻咽癌组织中的表达 鼻咽癌是鼻咽部上皮组织发生的常见的恶性肿瘤，但鼻咽癌的病因及发生机制目前尚未完全明确。USP22位于人类17号染色体(17p11.2)上，由14个外显子组成，其开放读框由1 578个碱基组成，可编码525个氨基酸。USP22是肿瘤干细胞标志家族中一个成员, 属于去泛素化酶蛋白酶超家族，具有去泛素化的作用，通过对底物靶分子的去泛素化修饰作用调节细胞内多种基因的转录发挥生物学功能[10]。目前研究认为USP22是恶性肿瘤表型的1个关键启动子，其作用是调节核受体和致癌信号[11]。目前已经发现USP22在人类许多恶性肿瘤细胞中呈高表达，如USP22在乳腺癌、食管癌、胃癌、直肠癌等多种肿瘤中高表达。但目前国内对USP22在鼻咽癌方面的报道罕见，故本研究我们采用免疫组织化学法对60例鼻咽癌患者和20例鼻咽黏膜慢性炎患者组织中的USP22的表达进行检测，60例鼻咽癌组织中，有36例组织中USP22表达呈阳性，阳性表达率60%(36/60)；20例对照组(鼻咽黏膜慢性炎组织)中，仅有2例USP22表达阳性，阳性表达率为10%(2/20)，USP22在鼻咽癌中的阳性表达率明显高于鼻咽黏膜慢性炎组织，差异有统计学意义(P<0.05)。这与近年来许多国内外权威杂志报道USP22在其他恶性肿瘤中有过表达的情况一致[12]，USP22可能在鼻咽癌肿瘤细胞的生长过程中扮演着重要角色，USP22可能是鼻咽癌病理诊断与鉴别诊断的指标之一。我们认为对可疑为鼻咽癌的病检活检组织检测USP22蛋白的表达情况可能有助于鼻咽癌的病理诊断与鉴别诊断。本实验结果USP22在鼻咽癌组织中的表达与淋巴结转移有显著的关系(P<0.05)，而与患者性别、年龄、病理分型等临床病理特征无明显相关性(P>0.05)，USP22的表达在有淋巴结转移的鼻咽癌组织中比无淋巴结转移的鼻咽癌组织高，差异有统计学意义(P<0.05)，这表明USP22可能参与鼻咽癌的淋巴转移过程。这与张琳等[5]报道USP22在结直肠癌组织中的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移、肝脏转移及Duke′s分期有关；郑文凤等[9]报道USP22在食管癌的表达与肿瘤浸润深度及组织学分级有关，而与淋巴结转移、年龄、性别无关；于金玲等[6]报道USP22在胃癌的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、有无远处转移相关，而与患者的年龄、性别、肿瘤大小无相关性等报道有些不一致，可能提示USP22在人类不同恶性肿瘤组织中的表达与其临床病理因素的关系不尽相同，也可能是由于各种原因无法对每一例患者一直随访，筛选研究病例的结果，以及由于本次实验收集的样本不够丰富、女性患者偏少、各种鼻咽癌病理分型的比例不够理想等原因也可能导致在医学统计学上还不能很好地反映出其表达规律，还值得需要我们更进一步的探究。

3.2 USP22蛋白与临床预后 由于本研究对象确诊时间尚未足5年，故暂时只统计3年OS和PFS指标，与USP22表达进行相关性分析。结果发现，USP22蛋白阳性表达的患者预后较差，USP22阴性表达的患者3年OS和PFS率明显高于阳性表达组，与于金玲等[6]报道在胃癌患者中USP22蛋白高表达的患者预后差，5年生存率低；常静[13]报道在宫颈癌患者中USP22蛋白阳性表达患者的3年生存时间显著低于USP22蛋白阴性表达患者的情况基本一致。提示检测鼻咽癌患者的USP22蛋白表达情况有助于临床判断患者的预后。

3.3 USP22基因与鼻咽癌治疗 目前以泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)为靶点的抗肿瘤药物逐年增多，硼替佐米(bortezomib)是首个被批准临床上用于治疗B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的泛素蛋白酶体抑制剂，2012年另一种泛素蛋白酶体抑制剂卡非佐米(carfilzomib)也被FDA批准用于多发性骨髓瘤的治疗[14]，显示出泛素蛋白酶体作为肿瘤有效治疗靶点的重要性，USP22属于去泛素化酶蛋白酶超家族，但目前还没有针对USP22基因的分子靶向药物。廖志伟等[15]在动物实验中发现,抑制USP22基因表达后，可使人鼻咽癌细胞株CNE-2裸鼠移植瘤生长受到抑制，裸鼠成瘤时间晚，瘤体生长明显减缓，在人体中有无相似的作用值得进一步深入研究。以USP22为靶点的抗肿瘤药物将成为研究热点，USP22有望成为鼻咽癌治疗的新靶点。

综上所述，USP22作为癌死亡标签中的一员，影响着肿瘤细胞的生长和增殖。目前已有越来越多的研究证实了USP22在多种恶性肿瘤细胞中高表达，且与疾病的进展和预后密切相关，这为日后开发以USP22为标靶的抗肿瘤药物提供了理论基础。USP22的在鼻咽癌组织中有过表达，USP22基因可能参与鼻咽癌的发生过程，USP22有望成为鼻咽癌的诊断与鉴别诊断、预后判断指标和治疗靶点。