范道春, 张红兵 ， 刘 垒

(河北经贸大学 生物科学与工程学院 食品安全管理研究所,河北 石家庄 050061)

生物柴油作为一种潜在的清洁能源，越来越受到关注，目前主要用蔬菜油[1]、菜籽油[2]、麻疯树油[3]和餐饮废油[4]等进行生产，但是产量低，在实际应用中难以满足人们对燃料的需求[5]。而光合微生物的脂肪酸组成与植物油相似，同时在脂质产量方面也要高于植物[6]，因此利用光合微生物生产生物柴油具有广阔前景。近年来，在生产生物能源方面，微藻具有的潜在价值越来越受到重视[7]。微藻被称为“微型阳光驱动的生物化工厂”，能够在有机物和二氧化碳存在的情况下生产大量的脂质和碳氢化合物[8]，同时具有优于陆地能源作物的优势，如光合效率较高、表面生产力强、不需耕地和低营养需求等[9]。目前，已有部分可再生生物燃料来源于藻类[10]，如来自中性脂质的生物柴油[11]、生物氢[12]、烃[13-14]、乙醇[15]和甲烷[16]等。对于微藻的研究，主要以野生型藻种为主，但因其生长缓慢、油脂积累能力低和环境适应能力弱[17]等缺陷，导致微藻在生产生物能源方面的应用受到限制。因此有必要对微藻进行育种和筛选，以获得最佳的优势藻种。

1 微藻的育种方法

1.1 物理方法

物理诱变主要是利用一些导致微生物发生基因突变的物理方法来进行育种，主要有紫外线、γ射线、离子诱变、中子诱变以及常压室温等离子体(ARTP)等。

1.1.1 紫外诱变 嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，从而引起突变。叶丽等[18]采用紫外照射对微绿球藻(Nannochloropsisoculata)进行诱变育种，筛选出2株突变藻株MN-1和MN-2，前者的总脂含量增加9.81%，二十碳五烯酸(EPA)增加1.81%，饱和脂肪酸(SFA)增加2.70%，而后者的多糖增加 13.26%，总脂增加7.93%，SFA 增加28.9%。Sivaramakrishnan等[19]利用紫外照射栅藻(Scenedesmussp.)，筛选出1株突变株M22，经2 mmol/L H2O2胁迫处理后，在相同条件下培养，突变藻株的总脂产量提高到1.625 g/L，较野生型增加了3倍。Liu等[20]对小球藻(Chlorellasp.)施加紫外线诱变，筛选出的突变藻株生物量较野生型提高了7.6%，脂质含量也不同程度增加，并且呈现更高的生长速率，结果表明，紫外诱变对小球藻非常有效。

1.1.2 射线诱变 通过射线将能量传递到微藻体内，引起染色体断裂和重排，如果无法修复或修复过程中出现碱基错配就会导致突变。Jongil等[21]对二形栅藻(Scenedesmusdimorphus)进行γ射线照射，筛选出的突变藻株Sd-Pm210的生长速率比野生型更高，其脂质含量增加了25%，用薄层色谱法分析脂质成分发现三酰基甘油的含量显著提高，脂肪酸甲酯的含量增加1.4倍左右，其中的脂肪酸主要是棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。吕小义等[22]利用60Co-γ射线辐照诱变裂壶藻(Schizochytriumlimacinum)，得到1株高产突变株1.6-7-1，其摇瓶发酵生物量为47.37 g/L，油脂含量为31.41%，二十二碳六烯酸(DHA)产量为5.65 g/L，较出发株提高了约40%，经连续5代发酵培养，其遗传性能稳定。Cheng等[23]采用137Se-γ射线对小球藻(Chlorellasp.)进行照射诱变，筛选出的突变藻株经驯化后，生物量和脂质含量分别提高25% 和54.9%。上述结果表明，射线育种可用于筛选生物燃料高产的藻株。

1.1.3 重离子诱变 重离子通常指原子序数大于4、失去全部或部分电子的所有带电粒子，它会导致生物体电离损伤，改变染色体序列或结构引起变异。Hu等[24]采用碳重离子对微藻(Desmodesmussp.)进行诱变，在24孔微量培养板上筛选出突变藻株D90G-19，其脂质生产力为0.298 g/(L·d)，比野生型藻株高出20.6%，结果表明，重离子辐射结合高通量筛选是提高微藻产脂能力的有效手段。王芝瑶等[25]利用碳重离子对微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)进行诱变，得到2株突变藻珠HP-1和HP-2，其生物量分别提高了18%和26%，油脂产率分别为295 mg/(L·d)和275 mg/(L·d)，突变藻株的生长速度和油脂产率较野生型藻株具有明显的优势。Ma等[26]通过碳重离子诱变微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)，获得1株较高生长速率的突变体HP-1，其生物量和最大生长速率分别增加19%和6%，脂质生产率从211 mg/(L·d)增加到271 mg/(L·d)，提高了28%。脂质组成经分析后发现，三酰甘油(TAG)含量增加了14%，极性脂质含量降低了15%，由于HP-1具有较高的脂质生产力，TAG含量高，可成为微藻生产生物柴油方面有价值的候选藻株。

1.1.4 低能离子束 低能粒子束注入藻细胞后因碰撞产生大量的自由基，损伤细胞的DNA引起突变，常用的低能离子束有N+、Ar+、Zn+、Fe+、C2+、C5+等。Fu等[27]将低能碳离子植入到裂壶藻(Schizochytriumlimacinum)中，获得的突变藻株S1的DHA生产能力比亲本藻株提高了61%，在最佳发酵条件下，S1的DHA产量可达到6.52 g/L，占总脂质的46.2%。Yang等[28]采用3 MeV C2+对菱形藻(Nitzschiasp.)进行诱变，筛选出了20株幸存藻株，平均脂质含量比野生型增加了9.8%。付杰等[29]对裂壶藻(Schizochytriumlimacinum)进行低能氮离子束诱变，选育出1株高产突变株15k-160s-2-3，其DHA产量为5.48 g/L，提高了约35%，生物量为47.66 g/L，油脂产量为14.42 g/L，经连续10代发酵培养，其遗传性能稳定，藻油脂肪酸组成简单，具有良好的商业前景。鉴于低能离子束诱变具有突变率高、突变谱广、操作灵活的特点，成为微生物和植物育种中新型强大的物理诱变工具。

1.1.5 中子辐射 通过产生高浓度活性氧，造成遗传物质的损伤和改变。Liu等[30]利用中子辐射诱变小球藻，以藻类细胞生长、总脂质生成能力为考察指标。研究发现，当中子辐射剂量为5.6×108n/cm2时，突变藻株的总脂质含量增加了20%，同时中子辐射缩短了生物量积累的周期，对生长没有负面影响。中子辐射诱变技术对于生物燃料的生产至关重要。

1.1.6 常压室温等离子体(ARTP) ARTP诱变育种仪能在大气压下产生具有高活性粒子浓度的等离子体射流，对遗传物质具有损害和改变作用。Liu等[31]采用ARTP对寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)进行诱变，筛选出高产突变藻株M7，其细胞外多糖(EPS)体积产量为1.02 g/L，生物量产量为0.39 g/g，分别提高了33.85% 和85.35%，经9代培养后其遗传性能稳定。研究表明，通过ARTP对海洋微藻C.cohnii的诱变是行之有效的。Fang等[32]通过采用纯氦气驱动的ARTP诱变钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)，以碳水化合物含量和生长速率为指标，使用96孔微孔板和酶标仪的高通量筛选，获得3株代表性突变藻株，其中3-A10和3-B2的碳水化合物含量分别提高了40.3% 和78.0%，而4-B3的比生长速率增长了10.5%。目前，ARTP作为有效的非转基因诱变工具，已成功应用于细菌、放线菌、真菌、酵母、微藻等在内的40余种微生物，应用前景广阔[33]。

1.2 化学诱变

化学诱变主要使用一些导致基因发生突变的化学诱变剂诱变处理，使遗传物质发生突变。常用的化学诱变剂主要有甲基磺酸乙酯(EMS)和N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)等。

1.2.1 EMS EMS作为一种烷化剂，可以直接作用于DNA的碱基和磷酸，使之发生烷化作用，经过脱嘌呤作用后导致DNA链上碱基缺失引起突变。Patel等[34]使用EMS对集胞藻6803(SynechocystisPCC 6803)进行随机诱变，筛选出的突变体D1的碳水化合物和脂质产量分别提高了46%和64%，D8的脂质产量提高了82%。Sachdeva等[35]使用EMS诱变得到用2株耐47 ℃高温的蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)突变藻株M18和M24，30 ℃培养后M18和M24的脂质含量分别增加了59.62% 和50.75%。Zhang等[36]通过EMS对2种沙漠微藻(Desmodesmussp.)S81和G41进行诱变，获得的突变体S5和G3的脂质含量分别为48.41% 和 46.01%，脂质生产率为19.83 mg/(L·d)和17.92 mg/(L·d)，脂质成分分析显示多不饱和脂肪酸(PUFA)和乙二醇含量减少，单不饱和脂肪酸(MUFA)和中性脂质含量增加，适用于生物柴油生产。虽然EMS具有突变频率高、诱变损伤轻等优势，但其本身具有致癌性和挥发性，操作者需要注意安全。

1.2.2 MNNG MNNG可直接与DNA作用并使其损伤，导致染色体异常。Iskandarov等[37]采用MNNG对绿藻(Paristochlorisincisa)进行诱变，筛选出富含dihomo-γ-亚麻酸(DGLA)且花生四烯酸(ARA)缺陷的突变体，在氮饥饿条件下培养14 d后生物量达到3.6 g/L，总脂肪酸含量达到39%，其中DGLA比例增加到32%，几乎不产生ARA。沈国明等[38]探讨了不同浓度的MNNG对雨生红球藻(Haematococcuspluvial)诱变后的影响，发现高浓度的MNNG对微藻的细胞膜、线粒体及叶绿体等伤害巨大，2.5 g/L的MNNG是雨生红球藻的最佳诱变浓度。由于化学诱变剂MNNG本身具有易燃、有毒、致癌等危害，操作人员使用时应谨慎。

1.3 基因工程育种

基因工程方法育种针对性强，减缓了随机诱变的盲目性和不可控性，有益于提高微藻的性能及稳定性。目前已经通过酰基-ACP硫酯酶(TE)的过表达，成功地增加了原核生物(如大肠埃希菌和蓝细菌)的脂肪酸(FA)含量，提高了微藻(如莱茵衣藻)的中性脂质产量[39]。刘飞飞等[40]将博来霉素抗性基因(ble)随机导入三角褐指藻基因组中，筛选出了2株突变藻株，其多不饱和脂肪酸 EPA(C20:5) 含量分别提高了4.70% 和3.40%，不饱和脂肪酸(如C18:1、C18:2)虽然含量较少，但在突变藻株中的含量都有不同程度的提高。

在基因操作中，利用随机导入基因的诱变方法，仍然具有目的性弱、不确定性高和工作量大的缺点，也会损伤微藻部分基因[41]。目前在微藻基因敲除方面的研究取得了新的进展，在最先进的CRISPR/Cas9系统中，由sgRNA指导的Cas9核酸酶可完成精准的基因敲除，实现了微藻基因改造的可行性[42-43]。该方法在微拟球藻(Nannochlorops)的硝酸还原酶的基因敲除实验中也得到证实[44]，在微藻基因改造育种领域中意义非凡。另外Kang等[45]通过轰击法将转录因子Bhlh导入微拟球藻中，获得能够表达NsbHLH2的转基因藻株3-6，在氮限制条件下，其脂肪酸甲酯(FAME)的生产力提高了33%。虽然基因工程育种能够控制转入的外源基因，但是对于转基因微藻的安全性，目前缺乏明确的结论[46]，有待观察。

表1 不同育种方法的原理和优缺点比较

2 富油脂微藻筛选方法

由于突变具有不可控性，成功率低，需要花费大量的时间和精力筛选微藻目的突变株。在富油脂微藻筛选方面，尼罗红染色法[35]和苏丹黑B染色法[27]是比较常见的筛选方法，而低场核磁共振技术和荧光激活细胞分选技术则是近年发展起来的具有应用前景的方法。

2.1 低场核磁共振技术(LF-NMR)

LF-NMR技术自推出40年以来，在量化油脂方面已经成功应用到油料勘探[56]、食品工业[57]等领域。LF-NMR的脂质定量基于样品分析各阶段中氢核松弛时间不同，如碳水化合物和蛋白质表现出微秒级的最短松弛时间，而结合水、游离水和脂质的释放时间分别为几微秒、几秒和几百毫秒[58]。Wang等[59]研究并评估了LF-NMR技术在检测小球藻细胞内脂质含量的可行性，表明LF-NMR对藻类脂质非常敏感，在干脂质样品和藻肉汤中的检测限(LOD)分别为0.002 6 g/L和0.32 g/L，定量限(LOQ)为0.009 3 g/L和1.18 g/L，为了降低游离水对信号的干扰，实验加入了5.0% 的MnCl2以确保游离水信号被完全去除，验证实验分别利用LF-NMR和GC-MS对3个干细胞样品和3个藻类肉汤样品进行脂质含量测定，比较发现，两者百分比差异小于2.0%，该方法还可应用于实时监测发酵过程中的脂质含量，可以更好地了解脂质积累机制和掌握动态生物过程控制，因此，LF-NMR在藻类脂质含量定量分析方面即准确又精确，考虑到该方法是直接测定培养液中微藻的脂质含量，可以避免有机溶剂、超声波等提取法对微藻细胞的破坏，由于活细胞中部分脂质存在于膜结构上或以蛋白质覆盖的脂滴形式存在于细胞质中，导致活细胞中脂质不能完全暴露于外部磁场，因此得到的LF-NMR响应强度比相应的干样品更弱，脂质含量测定值偏低。

2.2 荧光激活细胞分选技术(FACS)

FACS又称流式细胞仪，每秒可以实时检测几千个细胞，并可主动将细胞分离，实现了对大量单细胞利用同一组参数进行自动量化，在分离酵母、丝状真菌和所需的突变体细菌[60-61]等方面成功实施。Doan等[62]以EMS处理微拟球藻(Nannochloropsissp.)，并经FACS分选高脂质含量突变体，其总脂肪酸含量增加了4倍，其中棕榈油酸增加30%，二十碳五烯酸减少45%，表明使用随机诱变结合流式细胞分选技术，提高了高脂质含量突变藻株的筛选能力，有益于获取生物柴油原料脂肪酸构型的微藻突变体。

3 诱变致死率测定方法

SYTOX Green是一种非通透性的花菁染料，能轻松地透过质膜受损的细胞与核酸结合但不干扰细胞的生长，在488 nm激光光源激发下，荧光会增强500倍以上。Doan等[62]将SYTOX Green染料和EMS处理的微拟球藻(Nannochloropsissp.)混合至终浓度为0.5 μmol/L，室温下温育20 min，通过加入纯甘油提高SYTOX Greens的最佳浓度和染色时间，采用Epics AltraTM流式细胞仪测量绿色荧光活性，结果显示，以0.5、1.0和1.2 mol/L的EMS处理的藻细胞的致死率分别为57.3%、92%和100%，从0.5和1.0 mol/L的EMS处理的藻细胞中筛选出的突变株E2和E3，测定表明E2和E3的PUFA含量分别增加了50%和减少了20%，E3的总脂质含量最高。

4 展 望

利用物理方法进行突变育种，虽然操作简单、对人体的危害小，但所需设备价格昂贵，一次性投入高，难以推广。化学诱变法虽然克服了投入过高的弊端，但同样存在突变位点的不确定性，鉴于实验药剂大都是强烈致癌物，对人体和环境的友好程度差，实验操作者往往内心存在抵触和恐惧心理，再加上需要探讨致死率和突变率的最佳结合条件，费时费力，应用日趋减少。而利用基因工程手段进行定点突变，克服了上述两种方法带来的随机突变结果不可控的缺陷，甚至可以把其他物种中存在的特定基因克隆到微藻体内表达，构建新的特殊应用型微藻藻株，包括能源生产、污水处理等，但该方法需要对微藻遗传背景如基因序列、表达调控机制等具有足够了解。所以，富油脂微藻育种技术需要走的路依旧很长，仍需所有科研人员的共同努力。