肖 璇， 杨伟超， 杜蓓蓓， 徐 慧*， 赵临襄

(1.沈阳药科大学 制药工程学院，辽宁 本溪 117004；2.中国科学院 沈阳应用生态研究所 污染生态与环境工程重点实验室，辽宁 沈阳 110016)

虫草素(Cordycepin)，又名3′-脱氧腺苷(3′-Deoxyadenosine)，分子式为C10H13N5O3。虫草素是蛹虫草中的主要活性成分，也是从真菌中提取分离出来的第一个核苷类抗菌素[1]。虫草素具有抗菌、抗病毒、干扰人体RNA和DNA合成及显著抑制多种肿瘤细胞生长的作用[2-4]。此外，虫草素还有免疫调节、抗炎、抗衰老、扩张支气管等药理作用[5-6]。人们通常通过食用冬虫夏草(或蛹虫草)来达到保健及治疗的目的，而作为虫草核心功能成分的虫草素在人体肠道中的代谢机理尚不清楚。大量研究表明，中药中的某些化学成分可经肠道菌群代谢或转化，进而形成新的活性成分被人体吸收利用。杨秀伟等[7]发现，罗汉果皂苷Ⅲ经人体肠道内细菌转化后生成罗汉果皂苷ⅡA1和罗汉果醇，进而在体内体现出生物学活性。刘铁汉等[8]发现淫羊藿苷易被肠道内菌丛代谢。因此，推测虫草素极有可能被肠道菌群代谢或转化，产生新的化学成分进入人体从而发挥作用。干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)属于乳杆菌属(Lactobacillus)，是一种重要的肠道益生菌。L.casei广泛存在于食物与肠道中，因其能够耐受有机体的防御机制，包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小肠的胆汁酸等，所以L.casei可以在人体肠道内大量定殖。越来越多的研究证实，乳杆菌不仅能够调节机体胃肠道正常菌群，保持肠道微生态平衡，提高食物消化率和生物效价，还能够抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和有害代谢物的产生[9-10]。L.casei的上述功效使得以其为主要成分制成的系列产品(如食品、饮料、保健品等)深受广大消费者青睐，市场需求量巨大。近年来，以虫草与L.casei复合发酵形成的新食品与保健品相继出现[11-12]，开辟了虫草功能食品的新领域。然而，L.casei对虫草素是否有代谢，代谢后的产物对人体健康是否有影响，是目前虫草的生物活性机理研究和新产品开发过程中亟待解决的关键问题。为了阐明L.casei对虫草素的生物转化过程，本研究采用厌氧培养的方法对L.casei生物转化虫草素的过程进行了研究，为进一步研究肠道菌对虫草素的生物转化机制以及虫草素的药理作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，保存于中国科学院沈阳应用生态研究所环境微生物组。

1.1.2 药品与试剂 MRS培养基，虫草素(上海源叶生物，纯度≥98%)。

1.1.3 仪器 隔水式恒温培养箱(GNP-9080型)；厌氧袋，厌氧产气包(2.5 L，海博生物)；高效液相色谱(Younglin YL9100型)；戴安半制备液相色谱仪(DIONEX UltiMate3000型)；液质联用仪(色谱系统：Thermo Accela高效液相色谱系统；质谱系统：Thermo TSQ Quantum Access Max 三重四极杆质谱系统)；核磁共振波谱仪(Bruker-AV-600型)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌对虫草素的生物转化 ①L.casei菌体制备：取干酪乳杆菌种液，按5%(体积分数) 接种量接种至MRS液体培养基，37 ℃厌氧培养24 h。菌液于6 000 r/min离心10 min，去掉上清，菌体沉淀用无菌生理盐水洗3次(6 000 r/min×10 min)后于4 ℃保存备用。②L.casei对虫草素的生物转化：50 mg虫草素溶解于200 mL纯净水中，终浓度为0.996 mmol/L。将2 gL.casei(活菌数为3.6×109cfu/g)菌体转移至上述虫草素溶液中，混匀。对照组不接入L.casei，于37 ℃厌氧培养72 h。定时取样以HPLC法测定不同培养时间虫草素和代谢物，根据标准曲线计算对应的虫草素浓度。

1.2.2 转化产物的HPLC检测 将不同培养时间的培养液分别经0.22 μm的无菌滤膜过滤，收集滤液，用YL9100型高效液相色谱仪对代谢物进行检测。HPLC色谱条件：Welch Ultimate®AQ-C18, 5 μm, 4.6 mm×250 mm色谱柱，柱温35 ℃，流动相为8%乙腈，UV 260 nm，流速1 mL/min，进样量5 μL。

1.2.3 转化产物的LC-MS分析 利用LC-MS设备对滤液进行检测。①液相色谱条件：Welch Ultimate® AQ-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm色谱柱，流动相为8%乙腈，UV 260 nm，流速为0.8 mL/min。②质谱条件：离子源为ESI源，喷雾电压3 500 V，离子源温度270 ℃，雾化气压30 psi，辅助气压10 psi，毛细管温度320 ℃，质量扫描范围50.00 ～ 500.0 m/z。

1.2.4 转化产物纯品制备与数据分析 转化后溶液中的新产物经戴安半制备液相分离纯化，冻干，-20 ℃保存。半制备液相色谱条件：YMC-Pack ODS-A，5 μm，10 mm×250 mm色谱柱，流动相为8%乙腈，UV 260 nm，流速为2 mL/min。

1.2.5 虫草素与转化后产物的定量分析 取虫草素标准品与转化后新产物纯品，分别配成0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL溶液，经HPLC(色谱条件同1.2.3)进行检测，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并根据标准曲线计算对应浓度。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测与产物含量分析

HPLC检测结果显示，虫草素标准品的保留时间为8.45 min(图1)。虫草素经由L.casei转化后，在保留4.95 min时得到一个新产物(图2)，标记为CA。转化产物CA经半制备液相分离纯化，得到26 mg白色粉末状纯品。通过峰面积与浓度绘制标准曲线图(图3)，拟合方程：虫草素，Y=21 520X+34.328，R2=0.997 3；CA，Y=21 980X+24.974，R2=0.996 4。

图1 虫草素标准品的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of the cordycepin

图2 虫草素被L. casei转化后产物CA的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of the bio-transformed product CA

图3 虫草素与产物CA标准曲线Fig.3 Standard curves of the cordycepin and the CAA

L.casei对虫草素进行生物转化的时间动态测定，每12 h取样一次，由HPLC法测定虫草素和CA，根据标准曲线计算转化后的溶液中虫草素和CA浓度与未添加L.casei的对照组虫草素浓度，结果如图4所示。随培养时间延长，虫草素含量逐渐降低，CA含量不断上升，24～ 48 h的转化效率最高，72 h时CA含量最高，为0.229 mg/mL(摩尔浓度为0.908 mmol/L)，此时虫草素到CA的摩尔转化率达91.2%，转化过程基本完成。

2.2 L. casei对虫草素的生物转化产物鉴定

产物CA为白色粉末，LC-MS结果：ESI-MS m/z 253[M+H]+, 275[M+Na]+; 核磁数据：1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 8.42 (1H, s, H-2), 8.08 (1H, s, H-8), 5.87 (1H, d,J=

图4 转化过程中底物与产物含量分析Fig.4 Measurements of the product CA and the substrate cordycepin during the bio-transformation process

1.56 Hz, H-1′), 4.50 (1H, m, H-2′), 4.37 (1H, m, H-4′), 3.70 (1H, dd,J= 3.18 Hz,J= 12.06 Hz, H-5′a), 3.53 (1H, dd,J= 3.84 Hz,J= 12 Hz, H-5′b), 2.21 (1H, m, H-3′a), 1.89 (1H, m, H-3′b);13C-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 156.5 (C-6), 147.7 (C-4), 146.1 (C-8), 138.3 (C-2), 123.8 (C-5), 91.0(C-1′), 81.3 (C-4′), 75.3 (C-2′), 62.2 (C-5′), 33.8 (C-3′)。所得核磁数据与文献数据基本一致[13]，故鉴定化合物CA为3′-脱氧肌苷(3′-deoxyinosine)。

综合上述测定结果和虫草素化学特征，推测虫草素本身携带的氨基被L.casei水解为羟基，从而形成3′-脱氧肌苷的结构(图5)。

图5 虫草素的生物转化结果Fig.5 Result of biotransformation of Cordycepin

3 讨 论

研究表明，人体肠道菌群的作用与药物发挥疗效之间有着密不可分的联系。药物进入胃肠道系统后，其有效成分部分以原型物质直接被吸收，还有一部分经肠道菌群代谢后生成具有药效功能的新成分，进而达到治疗的效果[14]。虫草素作为一种具有多重功效的核苷类抗菌素，其在人体肠道中的代谢却鲜有相关报道。采用体外厌氧培养的方法，研究了肠道中数量多、被公认为最传统且最安全的益生菌—乳杆菌对虫草素的生物转化。结果表明，L.casei能够将虫草素的氨基水解为羟基，生成新的化学成分3′-脱氧肌苷。

人体的肠道菌群对药物的生物转化包括脱甲基[15]、脱羟基[16]、水解反应[17]、氧化还原反应[18-19]等。虫草素是一种嘌呤类的生物碱，其本身携带的氨基易被酸或酶水解，从而转变成新的化学结构。药理学研究表明，3′-脱氧肌苷是一种抗原虫药物。原虫一般寄生在人或动物的体内，有些种类的原虫会对人造成严重危害，例如疟原虫、利什曼虫、克锥氏虫等[20]。Wataya等[21]在1984年就曾发现3′-脱氧肌苷能够抑制利什曼原虫的生长和繁殖，从而保护宿主。Nakajimashimada等[22]发现3′-脱氧肌苷在抑制克锥氏原虫在宿主细胞内生长上有着和虫草素(3′-脱氧腺苷)同样的作用。由于迄今为止3′-脱氧肌苷还未曾在天然产物中分离出来[13]，故对3′-脱氧肌苷其他方面的药理活性研究较少，因此虫草素的生物转化与3′-脱氧肌苷生物活性之间的相关性，以及在肠道内由虫草素转化所得3′-脱氧肌苷的健康或医疗功效还需要进行更为深入的研究。

本实验室在益生菌对虫草素的生物转化作用的研究中还发现，并非所有的益生菌均能转化虫草素。双歧杆菌与粪肠球菌作为重要的肠道益生菌，并未发现它们对虫草素有代谢作用。至于肠道菌群中的其他菌群对虫草素有无转化作用，尚需进一步探究。