羊口疮病毒ORF019基因的克隆及表达

2019-03-25沈岩尔贾怀杰王晓霞陈国华何小兵房永祥薛慧文景志忠

甘肃农业大学学报 2019年6期

沈岩尔，贾怀杰，王晓霞，陈国华，何小兵，房永祥，薛慧文，景志忠

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部兽医公共卫生重点实验室，甘肃兰州 730046；3.兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所，甘肃兰州 730000)

羊传染性脓包性皮炎(contagious ecthyma，CE)俗称羊口疮(Orf)[1]，是由羊口疮病毒(orf virus，ORFV)引起的一种急性、高度接触性、嗜上皮性人兽共患病[2-6].主要感染绵羊和山羊，尤以羔羊或幼龄羊易感，口、唇、舌和乳房等部位形成以丘疹、水疱、脓包和痂皮为主要病理过程为特征[7-8].该病很少引起动物死亡，除非发生宿主免疫抑制或者继发感染，但也有报道称可引起幼龄山羊高达 93%的病死率[9-10].羊口疮呈世界性流行，广泛存在于所有养羊的国家或地区.我国的东北、西北、西南等多个省市自治区均有该病的发生.该病毒抵抗力强、传染性高，羊群一旦被感染则不宜清除，给畜牧业带来严重的经济损失，广泛影响我国养羊业的发展[11].近年来，有关人感染该病毒的临床病例报道不断增加[12-13]，除了多种反刍动物和一些野生动物外，也不断有人发生感染的报道[14].因此，该病的暴发和流行严重威胁世界养羊业的发展和人类的健康.

ORFV为线性双链DNA病毒，基因组的大小为134～139 kb之间，G+C含量约为63%[4,11,15]，与其他痘病毒科成员一样，ORFV基因组中间是大的中心编码区，两端为反向末端重复序列(inverted terminal repeat， ITR)[16-18].ORFV的中心编码区(ORF009～ORF111)为保守区，主要编码病毒复制、组装和释放所必须的相关蛋白及与病毒的毒力、免疫调节及宿主范围因子等相关蛋白.ORF019基因位于ORFV基因组的中心保守区域，第19个开放阅读框，约编码84 ku大小蛋白.本试验通过对该基因的克隆，利用生物信息学技术对核苷酸和其推导的氨基酸序列进行了分析和预测，以及构建原核表达载体pET-32a-ORF019，转化BL21(DE3)感受态细胞，进行原核表达，并进行纯化及反应原性鉴定，为进一步开发ORFV诊断试剂奠定基础.

1 材料与方法

1.1 菌株、菌株和载体

ORFV/QH02/2010分离株、pET-32a(+)原核表达载体均由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室分离、鉴定和保存；大肠埃希菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞均购自南京诺唯赞生物科技有限公司.

1.2 载体、工具酶及其他试剂

1.3 方法

1.3.1 引物的设计与合成参考GenBank中登录的ORFV OV-SA00株的基因组序列(登录号：AY386264)，根据编码ORF019基因序列，运用Oligo 6.0生物信息学分析软件，针对基因设计1对特异性引物，上游引物序列：5′-CGGGATCCATGCTGCAGCTGCTCAAGAGAT-3′；下游引物序列：5′-CCCAAGCTTTTTTCTGAACCCGCGATTATTG T-3′，其中下划线部分为BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，预计扩增片段大小为2 178 bp，以上引物由西安擎科生物技术有限公司合成.

1.3.2 病毒DNA的提取及ORF09基因的PCR扩增取200 μL ORFV/QH02/2010分离株细胞培养物，按照GeneJET病毒RNA/DNA提取试剂盒说明书提取ORFV基因组DNA.以提取的病毒基因组DNA为模板，利用合成的ORF019基因的上、下游引物进行PCR扩增.反应体系：5×Prime STAR GXL Buffer 20 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 8 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板2 μL，Prime STAR GXL DNA Polymerase 2 μL，用RNase Free ddH2O补至50 μL.扩增条件：95 ℃ 预变性 5 min，98 ℃ 变性10 s，55 ℃ 退火15 s，68 ℃延伸2 min，共进行35个循环；最终72 ℃ 再延伸 10 min.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶检测后，并利用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物.

1.3.3 重组表达载体的构建及鉴定将PCR产物和pET-32a(+)载体分别利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定、纯化回收、T4连接酶进行连接后，转化至E.coliDH5 α 感受态细胞，提取质粒并进行双酶切鉴定.最后，将鉴定为阳性的重组质粒送往擎科(西安)生物技术有限公司测序.

1.3.4ORFVORF019基因及其编码蛋白的生物信息学分析参考GenBank上公布的羊口疮ORF019基因序列，利用DNASTAR软件MegAlign程序中Clustal W方法对测序结果进行分析，ORFV参考毒株信息见表1.

表1 参考毒株

1.3.5 重组表达菌的诱导表达鉴定将测序正确的pET-32a-ORF019重组质粒和pET-32a(+)空质粒分别转化到BL21(DE3)pLys感受态细胞，挑取单菌落，接种到10 mL含Amp 抗性的LB液体培养基中，200 r/min、37 ℃过夜培养.取过夜培养的菌液以1∶100的比例接种到10 mL含有LB培养基中振荡培养至D600值约为0.6时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，22 ℃诱导表达 4～6 h 收菌.在诱导前、后分别取出1 mL菌液，进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达情况.同时设置未诱导pET-32a-ORF019重组质粒和pET-32a(+)空质粒作为对照.

1.3.6 重组蛋白的纯化扩大培养阳性种子菌2 000 mL，并以上述条件进行诱导后，4 ℃ 6 500 r/min离心10 min，收集菌体沉淀于50 mL离心管中，PBS洗涤菌液3次，最后用10～15 mL PBS重悬菌体沉淀，超声破碎裂解菌体(超声5 s，间歇5 s，总超声时间为30 min).超声后的液体于4 ℃、10 000 r/ min 离心20 min，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，确定该重组蛋白的表达形式.如果是以包涵体形式表达，则将收集的沉淀用8 mol/L尿素4℃过夜溶解，离心取上清，再与镍琼脂糖凝胶FF混合，于摇床4 ℃孵育过夜，按照镍琼脂糖凝胶说明书进行蛋白纯化.将纯化的重组蛋白溶液装入透析袋中依次用含有6、4、2 mol/L和不含尿素的PBS溶液进行透析，每个浓度透析24 h，将透析好的样品进行浓缩、-20 ℃保存.

1.3.7 重组蛋白的Western-blot 检测将诱导表达的蛋白进行SDS-PAGE电泳，PVDF膜与厚滤纸浸泡于电转液内，用湿转电转仪将蛋白质转到PVDF膜上；转膜结束后用含有5%的脱脂奶粉封闭2 h，之后用TBST洗涤3次，加入1∶1 000 稀释的兔源His标签抗体，4 ℃孵育过夜，同时设置对照组，再用TBST洗3次，每次10 min；然后用1∶10 000稀释的HPR标记的羊抗兔IgG，室温下孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，加ECL显色液显色.

2 结果与分析

2.1 ORF019基因的PCR扩增及其重组表达质粒的构建

琼脂糖凝胶电泳结果显示，在2 000～3 000 bp见可见一条特异性条带，与预期目的片段大小一致(图1)，重组质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，得到一条特异性片段与目的基因大小一致(图2)，结果表明ORF019基因的ORF被完整的插入到表达载体中，读码框正确，因此重组质粒命名为pET-32a-ORF019.

2.2 ORFV ORF019基因及其编码蛋白的生物信息学分析结果

测序结果与GenBank中登录的副痘病毒属的成员进行了一致性分析，发现ORFV QH02/2010株ORF019基因与ORFV国内外毒株的核苷酸序列一致94.8%～97.8%，其中与德国分离株D1707株(HM133903)的一致性最高为97.8%，与国内分离株NA1/11株(KF234407)的一致性96.8%；与其他副痘病毒属的痘病毒的一致性为73.1%～91.3%(图3).

M：DL 5 000 DNA marker ；1：PCR产物 PCR products.M:DL 5000 DNA marker;1:PCR product.图1 ORF019基因PCR扩增Figure 1 PCR electrophoresis of ORF019 gene

M：DNA Marke；1：重组质粒双酶切产物Double digestion products of recombinant plasmid.M:DL 2000 DNA Marker;1:Recombinant plasmid PCR product.图2 重组质粒的酶切鉴定Figure 2 Eneyme identification of recombinant plasmid

利用DNASTAR LaserGen 7.1 Megalign软件，对ORFV与脊椎动物痘病毒亚科各属代表毒株E2L蛋白的氨基酸序列利用Clustal W法对多序列直系同源性分析，结果显示(表1)，脊椎动物痘病毒亚科的不同属之间，E2L蛋白的氨基酸序列一致性在17.8%～79.1%之间，其中ORFV与其他脊椎动物痘病毒亚科的9株代表毒株的氨基酸序列一致性偏低，在17.8%～29.5%之间.

图3 副痘病毒属ORF019基因一致性分析Figure 3 Consistency analysis of ORF019 gene of Parapoxvirus

图4 脊椎动物痘病毒亚科E2L蛋白的一致性分析Figure 4 Consistency analysis of subfamily E2L protein of vertebrate poxvirus

2.3 重组蛋白的表达与鉴定

SDS-PAGE电泳结果显示，与对照空载体pET-32a菌液相比，重组质粒pET-32a-ORF019的

诱导菌在大小为100 ku左右有1条较粗的蛋白条带(图5).而未诱导的重组质粒的菌液和空载体的质粒转化菌均未出现相同的条带.

2.4 融合蛋白的可溶性分析

pET-32a-ORF019经诱导超声破菌之后，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳.结果显示重组蛋白主要存在于沉淀中(图6)，表明融合蛋白主要以包涵体的形式存在.

2.5 重组ORF019蛋白的纯化

经镍亲和层析柱纯化，SDS-PAGE电泳结果显示，经镍亲和层析柱纯化，SDS-PAGE电泳结果显示，洗脱浓度在300、400 mmol/L时重组蛋白pET-32a-ORF019被洗脱下来，流穿液和200 mmol/L洗脱液中蛋白含量比较高，但含有少量的杂带(图7).

M：蛋白质Marker；1：pET-32a-ORF019 IPTG诱导后；2：pET-32a-ORF019 IPTG诱导前；3：pET-32a IPTG 诱导后；4：pET-32a IPTG诱导前.M:Protein Marker；1：pET-32a-ORF019 after IPTG induction；2：pET-32a-ORF019 before IPTG induction；3：After pET-32a IPTG induction;4:Before pET-32a IPTG induction图5 His-ORF019重组蛋白的 SDS-PAGE 电泳Figure 5 SDS-PAGE electrophoresis of His-ORF019 recombinant protein

M：蛋白质Marker；1：pET-32a-ORF019诱导超声后的沉淀；2：pET-32a-ORF019诱导超声后的上清.M：Protein Marker；1：pET-32a-ORF019 induces post-ultrasound precipitation；2：pET-32a-ORF019 induces supernatant after ultrasound.图6 重组 pET-32a-ORF019 蛋白的可溶性分析Figure 6 Soluble analysis of recombinant pET-32a-ORF019 protein

M：蛋白质Marker；1：pET-32a-ORF019的上样液；2：pET-32a-ORF019蛋白过Ni柱纯化的流穿液；3～7：依次是Ni-Native-50、Ni-Native-100、Ni-Native-200、Ni-Native-300、Ni-Native-400过柱后收集的蛋白.M：protein Marker；1：pET-32a-ORF019 loading solution；2：pET-32a-ORF019 protein through Ni column purified flow through solution；3～7：Ni-Native-50,Ni-Native-100,Ni-Native-200,Ni-Native-300,Ni-Native-400 collected proteins.图7 重组 pET-32a-ORF019 蛋白的纯化Figure 7 Purification of the recombinant pET-32a-ORF019 protein

2.6 重组ORF019蛋白的Western-blot分析

Western-blot检测结果显示；重组质粒pET-32a-ORF019诱导表达的蛋白在约100 ku处有特异的阳性条带，而阴性对照则无任何特异性的条带(图8).说明ORF019蛋白在原核表达系统成功表达且具有良好的反应原性.

M：蛋白Marker； 1：pET-32a-ORF019 IPTG诱导后；2：pET-32a-ORF019诱导前；3：pET-32a(+)IPTG诱导后；4：pET-32a(+)诱导前.M：Protein Marker；1：pET-32a-ORF019 after IPTG induction；2：before pET-32a-ORF019 induction；3：After pET-32 a (+) IPTG induction；4：Before pET-32a (+) induction.图8 pET-32a-ORF019 蛋白 Western-blot 检测Figure 8 Western-blot detection of pET-32a-ORF019 protein

3 讨论

ORFV QH02/2010株ORFV019基因在ORFV不同毒株间一致性比较高，该基因具有相对较高的保守性，在副痘病毒属和脊椎动物痘病毒之间的一致性比较低.研究发现在细胞培养传代的衰减过程中，就会伴随着基因组的重新排列或者基因片段的丢失，这种现象已经在许多的痘病毒上证实，同样在ORFV上同样也有基因组片段删除的报道[15,19-20].因此碱基的缺失或者重排而导致ORFV QH02/2010株与德国分离株D1701亲缘性最高.结合痘苗病毒(vaccinia virus，VACV)的E2L基因的研究，其存在于成熟的病毒粒子中，且E2L蛋白的缺失会导致病毒粒子转运的严重抑制，并会使病毒毒力降低[21].ORF019编码蛋白与VACV E2L蛋白的结构相似，从而推测ORF019基因分子参与了细胞融合，对病毒粒子的转运有抑制作用.目前对于ORF019编码蛋白的研究尚未系统开展，因此，本研究旨在通过对ORFVORF019基因的克隆及其系列分析，进一步明确其在副痘病毒属(Parapoxvirus)成员，以及与脊椎动物痘病毒亚科其他痘病毒间的保守性，并通过其在原核表达系统的表达，获取重组表达产物，为进一步研究ORFVORF019基因编码蛋白的生物学功能和对疫苗的研究奠定基础.