魏谭军， 梁 源， 王 毅∗， 王 张， 肖 成， 胡凤娇， 周殿儒， 孙位军

（1.达州市中西医结合医院，四川达州 635000；2.成都中医药大学，四川成都 611137）

乳腺增生是育龄妇女最常见的乳房疾病，其发病率居乳腺疾病首位，近年来明显升高，多发于30～50岁妇女，癌变危险为健康妇女的1.4～1.5倍，癌变率为10%左右[1］。多发乳腺增生病可由不良刺激等因素导致女性内分泌功能紊乱，雌激素、孕激素比例失衡，刺激乳腺组织过度增生引起[2］。目前西医大多采用激素治疗[3］，中医认为，乳腺增生与肝肾冲任等脉有密切联系，而且中药在调节机体内分泌治疗乳腺增生疗效显著，已广泛应用[4-5］。

理气散结颗粒由柴胡、香附、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎、当归、白芍组成，具有理气调血、散结止痛的功效，主治肝郁血瘀、乳腺增生、乳癖结块、乳痈初起、乳房胀痛。本实验采用苯甲酸雌二醇和黄体酮诱导大鼠乳腺增生模型，探讨理气散结颗粒对该模型的影响。

1 材料

1.1 试药 理气散结颗粒 （批号151125）、理气散结丸 （批号160812） （达州市中西医结合医院）；他莫昔芬 （上海复旦复华药业有限公司，批号160503）；小金丸 （九寨沟天然药业集团有限责任公司，批号160114）；氯化钠注射液 （四川科伦药业股份有限公司，批号B16040811）；苯甲酸雌二醇注射液[6-10］（宁波第二激素厂，批号160623）；黄体酮注射液 （浙江仙琚制药股份有限公司，批号151216）；水合氯醛 （成都市科龙化工试剂厂，批号20100614）；多聚甲醛 （国药集团化学试剂有限公司，批号20161212、20160512）。大鼠E2ELISA试剂盒 （批号 XL-Er0478）、孕酮ELISA试剂盒 （批号 XL-Er0477）、雌激素受体（ER） （批号ab75635）、孕激素受体 （PR） （批号ab2765） （英国Abcam公司）。

1.2 仪器 电子天平 [赛多利斯科学仪器 （北京）有限公司］；低速离心机 （湘仪离心机仪器有限公司）；电子恒温水浴锅 （北京中兴伟业仪器有限公司）；全自动生化分析仪 （上海特康科技有限公司）；酶标仪 [赛默飞世尔科技 （中国）有限公司］；全玻璃注射器 （国营上海医用激光仪器厂）；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机 （常州市中威电子仪器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪 （常州市中威电子仪器有限公司）。

1.3 动物 SPF级SD雌性大鼠96只，体质量（200±20）g，购自成都达硕实验动物有限公司，四川省实验动物质量合格证号51203500001212，许可证号SCXK （川）2015-030。

2 方法

2.1 分组 大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、他莫昔芬组 （0.003 3 g／kg）、小金丸组（0.200 0 g／kg）、 理气散结丸组 （1.957 0 g／kg）及理气散结颗粒低、中、高剂量组 （0.978 5、1.957 0、 3.914 0 g／kg）， 每组 12 只。

2.2 造模及给药 空白对照组大鼠于后肢左右交替肌肉注射生理盐水 （0.1 mL／只）；其余各组大鼠每天肌肉注射苯甲酸雌二醇0.000 5 g／kg，共25 d，再每天肌肉注射黄体酮 0.004 0 g／kg，共5 d[11］。理气散结颗粒、他莫昔芬、小金丸临用前用生理盐水配成混悬液，于造模当天[11］灌胃给药，每天1次，连续30 d；空白对照组和模型对照组大鼠灌胃生理盐水，给药量均为20 mL／kg。

2.3 血清E2、P水平测定 末次给药后禁食不禁水24 h，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主动脉采血5 mL，3 000 r／min离心10 min分离血清，取上清液，ELISA试剂盒按酶联免疫吸附法，测定血清E2、P水平。

2.4 乳腺组织病理变化观察 取各组大鼠第2对右侧乳头及其下乳房组织[12］，4%多聚甲醛溶液固定，全自动脱水机脱水，石蜡包埋，部分进行HE染色，光镜下观察乳腺组织增生程度，对乳腺小叶、腺泡等计数，描述小叶导管和腺泡的分泌、上皮增生脱落情况及腺泡结缔组织，并按表1标准进行乳腺增生评级。

2.5 ER、PR蛋白表达检测 应用免疫组化法对大鼠乳腺组织中ER、PR蛋白进行阳性表达分析，在图像分析系统中测定两者光密度和面积。

2.6 统计学分析 通过SPSS 17.0软件进行处理，计量资料以s）表示，采用方差分析；等级资料采用非参数检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 乳腺组织病理变化 图1、表2显示，模型对照组大鼠乳腺组织中乳腺小叶和腺泡数量明显增加，腺上皮细胞排列虽较正常，但有空泡变性（10／12）、 增生 （6／12）、 脱落 （2／12）、 坏死（2／12）表现，部分间质因纤维组织增生而增宽，腺泡大小不等，管腔壁变薄；与模型对照组比较，理气散结颗粒低剂量组乳腺组织增生明显改善（P＜0.05），具体表现为3／10的乳腺组织无增生，乳腺小叶和腺泡数量减少，腺上皮细胞空泡变性、增生、脱落变化减少，无坏死。

表1 大鼠乳腺增生评级Tab.1 Rating of rat mammary gland hyperplasia

图1 各组大鼠乳腺组织病理形态变化 （HE，×400）Fig.1 Pathomorphological changes of rat mammary gland tissue in various groups（HE， ×400）

表2 各组大鼠乳腺组织病理切片等级Tab.2 Pathological section grades of rat mammary gland tissue in various groups

3.2 理气散结颗粒对E2、P水平的影响 表3显示，与模型对照组比较，理气散结高剂量组大鼠E2水平显著增加 （P＜0.05）；各剂量组P水平均无显著变化 （P＞0.05），但中、高剂量组降低作用显著强于理气散结丸组 （P＜0.05）。

3.3 理气散结颗粒对ER、PR蛋白表达的影响图2～3、表4显示，与模型对照组比较，理气散结颗粒中、高剂量组ER蛋白表达显著降低 （P＜0.05），同时高剂量组 PR蛋白表达也显著降低（P＜0.01）。

表3 理气散结颗粒对E2、P水平的影响 （Tab.3 Effects of Liqi Sanjie Granules on E2and P levels

表3 理气散结颗粒对E2、P水平的影响 （Tab.3 Effects of Liqi Sanjie Granules on E2and P levels

注：与模型对照组比较，∗P＜0.05；与理气散结丸组比较，#P＜0.05

空白对照组 — 10 124.92±18.92 5.07±1.00模型对照组 — 12 113.26±22.00 4.18±0.87他莫昔芬组 0.003 3 9 142.17±30.19∗ 4.67±0.63小金丸组 0.200 0 11 132.23±15.35∗ 4.69±0.65理气散结丸组 1.957 0 10 127.58±27.14 4.70±0.43理气散结颗粒组 0.978 5 10 127.41±18.96 4.54±0.62理气散结颗粒组 1.957 0 10 109.27±22.22 3.96±0.69#理气散结颗粒组 3.914 0 11 132.81±23.62∗ 4.23±0.47#

图2 各组大鼠乳腺组织ER蛋白表达 （IHC，×400）Fig.2 ER protein expressions of rat mammary gland tissue in various groups（IHC， ×400）

图3 各组大鼠乳腺组织PR蛋白表达 （IHC，×400）Fig.3 PR protein expressions of rat mammary gland tissue in various groups（IHC， ×400）

表4 理气散结颗粒对ER、PR蛋白表达的影响（Tab.4 Effects of Liqi Sanjie Granules on ER and PR protein expressions

表4 理气散结颗粒对ER、PR蛋白表达的影响（Tab.4 Effects of Liqi Sanjie Granules on ER and PR protein expressions

注：与模型对照组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1） 动物数／只 ER平均光密度 PR平均光密度空白对照组 — 10 0.229 0±0.006 5∗ 0.219 3±0.002 4∗∗模型对照组 — 12 0.239 5±0.003 1 0.232 3±0.001 7他莫昔芬组 0.003 3 9 0.236 2±0.004 0 0.225 0±0.005 0小金丸组 0.200 0 11 0.235 0±0.002 6∗ 0.221 2±0.008 7∗理气散结丸组 1.957 0 10 0.235 0±0.002 7∗ 0.227 9±0.003 2∗理气散结颗粒组 0.978 5 10 0.237 6±0.003 0 0.226 6±0.010 9理气散结颗粒组 1.957 0 10 0.235 0±0.002 0∗ 0.226 2±0.005 0理气散结颗粒组 3.914 0 11 0.234 0±0.003 4∗ 0.221 1±0.005 9∗∗

4 讨论

现代医学认为，雌激素、孕激素等性激素对乳腺发育及病理变化起着主导作用[13］。当体内雌激素水平绝对或相对增加，孕激素水平绝对或相对减少时[14］，乳腺组织将受到雌激素长期刺激，导致乳腺导管和小叶增生，同时促进组织水、钠潴留，进一步引起小叶间质水肿[15］，并且乳腺实质由于缺乏孕激素调节和保护而增生过度和复旧不全，从而引起乳腺导管上皮和纤维组织不同程度的增生和末梢腺管或腺泡形成囊肿，乳腺增生即是以这种增生和复旧的紊乱为基础[16-17］。本实验发现，各剂量理气散结颗粒对大鼠血清雌二醇 （E2）水平的影响与理气散结丸相当，但中、高剂量下降低孕酮（P）水平作用显著强于后者。

研究显示，雌激素受体 （ER）、孕激素受体（PR）过量表达可使乳腺增生、乳腺癌的发生发展加剧，其中前者信号对乳腺生长、发育、细胞凋亡有调控效应[8，18］。一般情况下，乳腺癌发展机制模式是 “正常→增生→非典型增生→原位癌→浸润性癌”[19］，由此可知非典型增生是癌变过程中的必经阶段。 目前， 多数学者认为[20］Wnt-2、 C-myc、ER、PR等因子与乳腺癌生长、发展、转移有关，同时乳腺腔分泌细胞的持续激活会导致乳腺癌发生[21］。有报道指出，乳腺是雌孕激素的靶器官，雌孕激素受体ER、PR能与雌孕激素特异性结合，乳腺增生发生与雌孕激素及雌孕激素受体紊乱有密切关系[22］。本实验发现，中、高剂量理气散结颗粒能显著降低大鼠乳腺组织中ER蛋白表达，同时高剂量下还能显著降低PR蛋白表达，与理气散结丸作用相当。

从乳腺组织病理学来看，理气散结颗粒对大鼠乳腺组织增生有明显治疗作用，具体表现为部分大鼠乳腺组织无乳腺增生，其余乳腺小叶和腺泡数量降低，腺上皮细胞空泡变性、增生、脱落减少，无坏死，与理气散结丸作用相当。其中，低剂量下作用最明显，其次为中、高剂量，其原因有待进一步研究。

理气散结颗粒是由大蜜丸理气散结丸改变剂型所得，与原剂型相比不仅有保存药效、质量稳定、服用量小的优点，而且能更好、更广泛地应用于临床，市场规模大，前景良好。中医认为，乳腺增生属于 “乳癖”“乳中结核”范畴，理气散结颗粒中柴胡疏肝解郁，为君药；香附理气疏肝，助柴胡疏肝解郁，与当归、川芎、延胡索同用，增加其活血行气止痛之功效，共为臣药；青皮理气化滞，白芍、甘草养血柔肝、缓急止痛，均为佐药；蜂房、山慈姑消痈散结，与甘草调和诸药同用，共为使药，全方共奏疏肝解郁、活血行气止痛之功效，从而治疗乳癖。

综上所述，理气散结颗粒可降低大鼠乳腺组织中ER、PR蛋白表达，减少与E2、P的特异性结合，从而缓解雌孕激素紊乱和乳腺增生，其机制可能与改善乳腺组织中ER、PR蛋白表达有关。