李 菁， 马东来， 刘宏伟， 冯建明， 李静娟， 郑玉光

（河北中医学院药学院，河北石家庄 050200）

金银花为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾，具有清热解毒、抗菌消炎等功效，是传统的药食两用大宗药材，近些年由于需求增加，其种植面积不断扩大[1-3］。金银花鲜品含水量约为80%，颜色绿白、气味清香，药效成分含有量高，而2015版 《中国药典》规定按干燥品计算，含木犀草苷不得少于0.050%，绿原酸不得少于1.5%，但它在贮存、运输、干燥过程中木犀草苷含有量时常下降，低于药典要求。课题组前期研究结果表明，金银花在干燥过程中会产生不同程度褐变，造成外观颜色劣变，并伴随有绿原酸、木犀草苷等药效成分降解，导致其药用价值降低，并直接影响其品质、外观和商业价值[4-6］。

金银花在加工中出现的颜色劣变属于酶促褐变[7］，主要是由多酚氧化酶催化酚羟基类化合物，再发生反应生成醌类化合物及其聚合物的过程。目前，防止金银花褐变的主要措施有热风干燥、真空干燥、微波真空联合干燥、热泵远红外联合干燥等，但存在设备投资大、对金银花中指标性成分木犀草苷含有量提高不明显等问题[8-11］；近年来，也有采用抗坏血酸、4-己基间苯二酚、L-半胱氨酸、柠檬酸、丙酮等单一抑制剂对金银花多酚氧化酶进行体外抑制的报道[12］。

本实验通过单一抑制剂处理金银花，经热风干燥后，考察其对木犀草苷、绿原酸含有量的影响，然后在此基础上筛选多酚氧化酶复合抑制剂，为减少贮藏和加工过程中金银花产生褐变及药效成分损失提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20A型高效液相色谱仪，配置SPD-20A检测器 （日本岛津公司）；Milli-Q©Referenen系统超纯水机 （北京博奥恒信生物有限公司）；PH-140A型立式电热鼓风干燥箱 （上海一恒科学仪器有限公司）；ME204E型电子天平 [十万分之一，梅特勒-托利多仪器 （上海）有限公司］；高速中药粉碎机 （浙江荣浩工贸有限公司）；KQ-250DE型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 维生素C、β-环糊精、植酸、柠檬酸、曲酸、L-半胱氨酸、4-己基间苯二酚 （食品级，河南天兴食品添加剂有限公司）；无碘食盐 （中盐河北盐业专营有限公司）；木犀草苷、绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院）。乙腈、甲醇为色谱纯 （美国Fisher公司）；甲醇、乙醇、冰醋酸、磷酸、磷酸氢二钠均为分析纯；水为高纯水（自制）。

1.3 药材 金银花采自河北中医学院药园、河北省邢台市巨鹿县堤村乡纪家寨，经河北中医学院药学院郑玉光教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾。

2 方法

2.1 木犀草苷、绿原酸含有量测定 绿原酸含有量测定方法采用2015版 《中国药典》，木犀草苷含有量测定方法在药典基础上进行改进。色谱条件为 Intertsil©ODS-3色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.5%冰醋酸，梯度洗脱 （0～15 min，10%～19%乙腈；15～32 min，19%乙腈；32～38 min， 19% ～35% 乙腈； 38～40 min， 35% ～10%乙腈； 40～50 min， 10% 乙腈）[2］； 体积流量1.0 mL／min；柱温20℃；检测波长350 nm。

2.2 单因素试验

2.2.1 pH值 取25 g新鲜金银花，共5份，置于pH值4、5、6、7、8的250 mL磷酸缓冲液中浸泡60 min，取出，沥干，40℃热风干燥至恒定质量，测定木犀草苷、绿原酸含有量。

2.2.2 浸泡时间 取25 g新鲜金银花，共5份，置于pH值为5的250 mL磷酸缓冲液中浸泡0、20、40、60、120、240 min，取出，沥干，40℃热风干燥至恒定质量，测定木犀草苷、绿原酸含有量。

2.2.3 料液比 取25 g新鲜金银花，共5份，加入pH值为 5的磷酸缓冲液 0、100、150、200、250、300 mL，浸泡时间为最佳时间，取出，沥干，40℃热风干燥至恒定质量，测定木犀草苷、绿原酸含有量。

2.2.4 单一抑制剂试验设计 以木犀草苷、绿原酸含有量为评价指标，将维生素C、食盐、β-环糊精、曲酸、4-己基间苯二酚、柠檬酸，半胱氨酸、植酸配制成不同质量浓度溶液 （表1），在最佳浸泡时间、料液比条件下进行单因素试验，考察其对金银花褐变的抑制效果。

表1 单一抑制剂试验设计Tab.1 Design of tests for single inhibitors

2.2.5 复合抑制剂试验设计 根据单一抑制剂试验设计结果，选取抑制效果较好的维生素C、曲酸、β-环糊精、食盐，通过Box-Behnken响应面法进行复合抑制剂组成优化。因素水平见表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

3 结果

3.1 单因素试验 图1A显示，pH值为5时绿原酸、木犀草苷含有量最高，故确定pH值为5。图1B显示，浸泡时间40、60、120 min时木犀草苷含有量均较高，而120 min时绿原酸含有量最高，故确定浸泡时间为120 min。图1C显示，料液比为1∶8时绿原酸含有量最高，而木犀草苷含有量也接近最高值，故确定料液比为1∶8。

3.2 单一抑制剂

3.2.1 维生素C、食盐 维生素C具有还原性，可促使内源性酚类物质氧化成的邻醌还原，此外还能作为酶螯合剂作用于多酚氧化酶中的铜离子，从而起到抑制褐变的作用[13］。图2A显示，维生素C可明显提高木犀草苷、绿原酸含有量，其质量浓度为0.2 mg／mL时达到最高；但其质量浓度继续提高时两者含有量反而有所下降，这与 “3.1.1”项下pH值结果相符，溶液pH过低，抑制效果也有所下降。

图1 各因素对木犀草苷、绿原酸含有量的影响Fig.1 Effects of various factors on galuteolin and chlorogenic acid contents

食盐中的Na+可与多酚氧化酶结构中的Cu2+产生竞争，降低其活性，从而抑制褐变[14］。图2B显示，当食盐质量浓度为10.0 mg／mL以上时绿原酸含有量明显增加，20.0 mg／mL时最高；对于木犀草苷而言，食盐质量浓度在2.0～40.0 mg／mL之间时其含有量均明显提高，而且无显著差异。

3.2.2 β-环糊精、曲酸 β-环糊精既可抑制邻苯醌及以后聚合物质的生成，又能与多酚氧化酶结合而抑制后者活性[13］。图3A显示，β-环糊精对木犀草苷、绿原酸含有量均有一定程度提高，其质量浓度在0.5 mg／mL以上时木犀草苷含有量提高程度较稳定，而在1.0 mg／mL时绿原酸含有量最高。

曲酸是微生物产生的一种代谢物弱酸，可抑制多酚氧化酶活性，并具有抑菌作用[15］。图3B显示，曲酸可明显提高木犀草苷含有量，其质量浓度为5.0 mg／mL时提高了48.21%，并对绿原酸含有量也有一定程度提高。

图2 维生素C （A）、食盐 （B）对木犀草苷、绿原酸含量的影响Fig.2 Effects of vitamin C （A） and salt（B） on galuteolin and chlorogenic acid contents

图3 β-环糊精 （A）、曲酸 （B）对木犀草苷、绿原酸含有量的影响Fig.3 Effects of β-cyclodextrin （A） and kojic acid （B）on galuteolin and chlorogenic acid contents

图4 酸性抑制剂对木犀草苷、绿原酸含有量的影响Fig.4 Effects of acid inhibitors on galuteolin and chlorogenic acid contents

3.2.3 酸性抑制剂 柠檬酸抑制褐变机制是分子中的羧基对多酚氧化酶中的铜离子有较强络合作用[13］，但图4A显示它对木犀草苷、绿原酸含有量的提高程度不明显，这是因为该成分还可降低体系pH值以促进褐变进行，故对金银花多酚氧化酶活性的抑制效果较差。4-己基间苯二酚抑制褐变机制是与多酚氧化酶结合使其失去催化活性[13］；L-半胱氨酸是一种可溶性氨基酸，结构中的巯基（-SH）可与酶促褐变产生的醌形成稳定无色化合物，从而抑制褐变[16］；植酸又名肌醇六磷酸，其结构中的6个磷酸基团使其具有很强的络合能力，而且在很宽的pH值范围内可络合多酚氧化酶中的铜辅基，从而抑制褐变[17］，但图4B～4D显示这3种抑制剂对木犀草苷、绿原酸含有量均无明显提高作用。

3.3 复合抑制剂 在单一抑制剂实验结果基础上，以维生素C （A）、β-环糊精 （B）、 曲酸 （C）、食盐 （D）质量浓度为影响因素，木犀草苷含有量提高率为评价指标 （Y），Box-Behnken响应面法优化复合抑制剂组成，结果见表3。

表3 试验设计及结果Tab.3 Design and results of tests

然后，通过Design Expert 8.0.6软件对表3数据结果作多元回归分析，得到多元二次回归方程为Y＝32.14+1.29A+1.07B+11.14C-6.73D+5.13AB+2.92AC-2.60AD+0.23BC+0.41BD-2.81CD+2.43A2-5.07B2+0.026C2+0.34D2， 方差分析[18］见表4。由表可知，模型P＜0.000 1，表明模型极显著；失拟项P＞0.05，表明模型拟合程度良好；R2为0.971 5， R2adj为0.943 1，表明模型与数据拟合合理，精度较好，而且实验值与预测值之间存在较高的相关性；因素C、D、AB、B2对木犀草苷含有量提高率影响极显著 （P＜0.01），AC、AD、CD、A2对其影响较显著 （P＜0.05）；各因素影响程度依次为 C＞D＞A＞B。

响应面分析见图5，可知与方差分析结果一致。通过Design-Expert 8.0.6软件，得到复方抑制剂最佳组成为 0.2 mg／mL维生素 C，2.3 mg／mL β-环糊精， 8.0 mg／mL 曲酸， 10.6 mg／mL 食盐，木犀草苷含有量提高率56.18%。再以最佳组成进行3批验证试验，测得木犀草苷含有量提高率分别为55.13%、56.79%、54.92%，平均55.61%，与预测值56.18%相当 （偏差率为1.73%），表明模型合理，预测性良好；绿原酸含有量提高率分别为10.69%、9.23%、9.45%，平均 9.79%，表明复合抑制剂能很好地提高金银花品质。

4 结论

图5 各因素响应面图Fig.5 Response surface plots for various factors

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

本实验筛选金银花多酚氧化酶抑制剂，得到其复方抑制剂最佳组成为 0.2 mg／mL维生素 C，2.3 mg／mL β-环糊精， 8.0 mg／mL 曲酸， 10.6 mg／mL食盐，在料液比1∶8条件下浸泡金银花120 min后经热风干燥，测得木犀草苷含有量提高率达到55.61%，可有效改善其他加工方法对其含有量提高不明显的状况，并且与预测值56.18%高度吻合，模型拟合度较好。此外，该复合抑制剂对绿原酸含有量也有一定程度提高，对金银花产地加工具有较高的实用价值。