刘颖新，刘利利，毛群芳，彭丽英，陈 容

(湖南中医药高等专科学校 药学系，湖南 株洲 412012)

四物汤来源于《仙授理伤续断秘方》一书，是临床上补血、活血兼顾的代表方剂。四物汤由熟地、当归、白芍、川芎四味药配伍组成，主要用于治疗营血虚滞所致的血虚失养、月经不调[1-2]等症。前期研究表明，四物汤补血作用有效部位为多糖、二氯甲烷和正丁醇部位。基于中药复方协同作用，本研究采用均匀设计法对四物汤中3种起补血作用的主要部位进行配伍研究，以筛选出四物汤补血有效部位的最优配比，并对配比后的有效部位补血机制进行了探讨。

1 动物、试药与仪器

SPF级雌性昆明小鼠，体质量18～22 g(长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2014-0011)。

熟地、白芍、当归、川芎均购于长沙佰佳药材公司，经湖南中医药高等专科学校生药教研室罗红梅副教授鉴定，分别为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的炮制加工品、毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)的干燥根、伞形科植物当归(Angelicasinensi(Oliv.)Diels.)的干燥根和伞形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根茎。自行提取，分离得到多糖部位、二氯甲烷部位和正丁醇部位备用。环磷酰胺(批号：17052531，0.2g/支，江苏盛迪医药有限公司)，驴胶补血颗粒(批号：201706058，20 g/袋，九芝堂股份有限公司)。Na+-K+-ATP酶活性检测试剂盒(批号：160506，南京建成生物工程研究所)；白细胞介素-3(IL-3)及促红细胞生成素(EPO)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。

BC-5000型血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；Model 680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)；JA2603B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 动物模型的制备

参照文献[3-4]，采用ip环磷酰胺的方法制备小鼠血虚模型。小鼠ip给予环磷酰胺生理盐水溶液40 mg/kg，连续3 d。

2.2 分组与给药

将提取的四物汤多糖、二氯甲烷和正丁醇3个补血有效部位作为考察因素，根据前期研究的有效剂量和相关文献[5]，分别确定3个部位的剂量范围为多糖1 000～1 600 mg/kg、二氯甲烷15～75 mg/kg、正丁醇14～62 mg/kg。按照U7(76)均匀设计表安排试验，得到均匀设计试验方案，见表1。将实验动物100只，随机分成10组，每组10只，采用ip环磷酰胺复制小鼠骨髓造血功能抑制模型，以外周血象、脾脏指数和胸腺指数为考察指标。根据表2方案，按剂量配比配制灌胃液，ig给药，同时设对照组和驴胶补血颗粒阳性药物组，阳性药物组按12.13 g/kg剂量ig给予驴胶补血颗粒(按照临床给药剂量2倍折算成动物给药剂量)。实验动物适应性饲养3 d，对照组每天ig 0.5 %CMC-Na，连续8 d。模型组每天ig 0.5%CMC-Na，连续8d，并在第4天起ip CTX(40 mg/kg)，连续给药3 d。各给药组每天ig不同配比的有效部位灌胃液，共8 d，并于开始给药的第4天起ip CTX(40 mg/kg)，连续3 d。阳性药物组每天ig驴胶补血颗粒共8 d，于第4天起ip CTX(40 mg/kg)，连续3d。于第9天将各组试验动物摘眼球取血适量，一部分用于血常规检测，另一部分用于红细胞膜中Na+-K+-ATP酶活性和IL-3、EPO含量测定。

表1 因素水平表 (mg/kg)

表2 给药方案 (mg/kg)

2.3 指标检测

各组动物于第9天采用摘眼球取血适量，置于抗凝EP管(EDTA)中，通过血细胞分析仪检测血常规，指标包括红细胞计数(RBC)、红细胞比容(HCT)、血红蛋白(HGB)等3项指标。测定Na+-K+-ATP酶的活性，严格按试剂盒说明书要求进行测定，酶活性以每毫克蛋白每小时所产生的无机磷的量来表示(单位：μmol·mg-1·h-1)。另取适量全血置于无抗凝剂的EP管中，按照ELISA试剂盒说明书要求测定血清中IL-3和EPO含量。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 四物汤有效部位不同配比对血虚模型小鼠外周血象的影响

结果见表3，与对照组比较，模型组小鼠HCT、RBC、HGB明显降低(P<0.01)。与模型组比较，给药A、B、G组明显升高HCT、RBC(P<0.05、P<0.01)；C、E组明显升高HCT、RBC、HGB(P<0.05)；D组明显升高HCT和HGB(P<0.05)；F组RBC升高和HGB作用显著(P<0.01)。

表3 四物汤有效部位不同配比对血虚模型小鼠外周血象的影响

注：与对照组比较：#P<0.05,##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05,**P<0.01，下同；#P<0.05,##P<0.01 vs contrl group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group,same as below。

表4 指标评分

3.2 四物汤补血有效部位最优配比

分别以HCT、RBC、HGB综合得分为指标，经二次多项式逐步回归法对数据进行处理，经二次多项式逐步回归，得到回归方程：

Y=86.8+7.62×10-3X1+3.29×10-2X2+0.265X3-2.57×10-4X1X3-2.88×10-4X32(X1为多糖部位，X2为二氯甲烷部位，X3为正丁醇部位)。方程经过调整后r=0.9999，S=0.0685，F=1091，F0.05(5,1)=230.2,F>F0.05(5,1)，回归方程显著。此方程中各因素的最优配比为：X1=1 600mg/kg；X2=75mg/kg；X3=14 mg/kg。

3.3 四物汤补血有效部位配比优化方的验证

KM小鼠50只，随机分为5组，每组10只。分别为对照组、模型组、阳性对照组(驴胶补血颗粒12.13 g/kg)、四物汤补血有效部位配比优化方组(即多糖1 600mg/kg+二氯甲烷部位75mg/kg+正丁醇部位14mg/kg)和四物汤组(生药6.37 g/kg)。按2.2项方法给药，以HCT、RBC和HGB作为药效学评价指标，结果见表5。配比优化方组RBC和HGB与模型组相比，差异非常显著(P<0.01)，HCT与模型组比较，差异显著(P<0.05)。与四物汤组相比，配比优化组对HCT、RBC和HGB的升高作用与四物汤组相当，表明经优化后的组方有较好的补血效果。

表5 配比优化方验证试验结果

3.4 四物汤有效部位配比优化方对IL-3、EPO及红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影响

与对照组比较，模型组IL-3、EPO含量和Na+-K+-ATP酶水平降低非常显著(P<0.01)。与模型组比较，配比优化方能显著升高IL-3和Na+-K+-ATP 酶水平(P<0.05)；升高EPO水平作用非常显著(P<0.01)。结果见表6。

表6 配比优化方对红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性、IL-3及EPO的影响

4 讨论

我国中药配伍理论是传统医学之精华。利用现代医学理论、技术与数学理论相结合深入探究中药配伍内涵，进一步阐明药效物质基础，是中医药现代化的要求和任务[7]。均匀设计将数论和多元统计相结合，尤其适用于多因素和多水平的试验研究。在条件变化范围大且需要较多水平试验的情况下，与正交设计相比，可明显减少试验次数，并通过回归方程得出最佳实验条件[8-10]。本试验采用均匀设计对四物汤中3种补血有效部位进行最佳配比研究，实验结果表明，四物汤3个有效部位的7种组合均有不同程度的补血作用。经均匀设计得到的回归方程所预测的最佳配比疗效确切，并与四物汤原方疗效相当，表明运用均匀设计法结合药效学试验优化中药有效部位配比的方法是可行的。

白细胞介素-3(IL-3)，又名多向集落刺激因子(multi-CSF)，它由T淋巴细胞产生，是细胞因子家族中的一员。IL-3属于正向调节性因子，能够调节造血干细胞的增殖与分化，对造血细胞尤其是对巨核细胞有重要的调节功能[11-13]。本研究中，模型组小鼠与对照组比较血液中的IL-3含量显著降低，四物汤补血有效部位配比优化方对小鼠血液中的IL-3含量影响显著，推测配比优化方补血作用是通过调节IL-3的生成而起作用。促红细胞生成素(EPO) 是一种特异性作用于红系祖细胞的激素糖蛋白，它在机体中对红细胞的生成有增强作用，当红细胞数量减少或携氧能力下降时，可刺激肾脏生成和释放EPO,促进骨髓内红细胞的生成[14-15]。本研究结果表明，与空白对照组比较，模型组小鼠血清中EPO水平明显降低，这可能是由于红系祖细胞被大量破坏，从而造成血清中EPO水平明显降低。四物汤配比优化方可促使血清中EPO水平明显升高，表明配比优化方可以促进肾脏大量合成EPO进入血清。Na+-K+-ATP酶作为一种存在于细胞膜上的跨膜蛋白，它可以调节细胞内的Na+、K+离子浓度，维持正常膜电位和细胞渗透压。Na+-K+-ATP酶对于维持正常红细胞形态、结构、功能具有重要作用[16,17]。血虚证最主要的病理表现是红细胞数量减少，研究表明，红细胞数量的减少可引起机体的新陈代谢减慢，从而导致红细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性随机体新陈代谢的减弱而降低。本研究中，四物汤配伍优化方组与模型组比较能够显著提高Na+-K+-ATP酶活性，使红细胞恢复到正常的形态和功能。

综上所述，经过均匀设计优化后得到的四物汤有效部位配比方在补血效果上与四物汤原方相当，成分更清楚，质量更易控制，符合中医药现代化的要求。其补血作用可能与增强Na+-K+-ATP酶活性，提高IL-3和EPO水平有一定相关性。