石晓兵，董 红，卿胜奎，郑新宝，罗永明，贾志虎，刘武军*

（1.新疆农业大学，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830011；3.加盛太平洋科技文化（北京）有限公司，北京 100000）

引 言

超数排卵和胚胎移植技术可以快速提高优良品种的繁殖效率[1]，影响超数排卵和胚胎移植的因素包括有牛品种、个体差异、激素、饲养水平和季节等[2]。 在实际生产中要获得好的胚胎移植效果，必须提高良种母牛的超排采卵可用率和受体牛可用率。 一般推荐使用成年牛进行超数排卵效果稳定，较少利用青年牛，但在生产中由于使用成年牛会耽误正常繁殖配种时间，而选择育成青年牛超数排卵，可以充分利用肉牛配种前的空闲两个月时间，充分挖掘良种肉牛的资源优势，提高繁育效率[2]。

日本和牛是日本多年培育的一种新品种肉牛，适合亚洲饲养管理环境，肉多汁细嫩，风味独特，肉用价值高[3]，我国引入时间不长，主要在东北、内蒙、海南分布，纯种数量较少，东北地区的饮食习惯烧烤喜欢用优质牛肉，和牛肉分割产品供不应求，为了快速扩大纯种和牛种群数量，许多养殖场进行了和牛胚胎移植技术研究与推广，笔者将近两年和牛胚胎移植试验结果分析总结，供同行参考。

1 材料与方法

1.1 供受体牛的选择

供体牛为黑龙江省齐齐哈尔市畜牧园区11～13 月龄青年和牛27 头， 备选受体牛群为当地养殖场荷斯坦和延边杂种后代母牛280 头，年龄为2～4 岁，均健康无病，生殖系统繁育功能正常。 空胎、全舍饲、自由饮水，膘情适中；和牛冻精由黑龙江冻精中心提供。 受体牛发情后6～7 d 移植胚胎。

1.2 器械、药品试剂

冲卵器械：采卵管、港芯、0.25 塑料细管、胚胎移植枪、移植外套购自法国卡苏公司，集卵皿由日本富士平公司生产，胚胎冷冻仪为澳大利亚CL5500。

促卵泡素（FSH）,400 mg/瓶，20 mL，加拿大生产；氯前列腺醇（PG），0.2 mg/支，宁波三生激素厂生产；CIDR 栓为新西兰生产，冲卵液和胚胎冷冻液,均为美国ICP 公司生产，维生素AD 为北京立时达药业有限公司生产，亚硒酸钠维生素E 注射液为上海恒泰药业公司生产。

1.3 供体超数排卵和受体同期发情方案

采用的阴道栓+促卵泡激素+前列腺素的超排方案[4]。一个超排过程17 d。为达到鲜胚移植目的，采取阴道栓同期发情程序与PG 法处理备选受体， 从而达到受体与供体同步发情的目的。 超排方案采用FSH 4 d递减注射法处理，即供体母牛在埋栓后第9～12 d 开始超排，FSH 分4 d 减量注法注射，第3 d 早晚各注射PG 2 支，FSH（加拿大生产）400 mg 溶解为20 mL，超排注射总剂量分为10 mL（200 mg）、11 mL（220 mg）和12 mL(240 mg)、13 mL（260 mg）四组。 供体母牛在超排第5 d 早晨试情，当天下午和次日早晨对发情供体各人工输精一次，每次使用和牛细管冻精2 支。

1.4 胚胎采集和移植

在供体牛发情后7 d，用非手术方法进行胚胎采集。采集前用手直肠检查黄体数，预估胚胎数，按国家奶牛非手术采卵操作规程进行采卵操作后，将回收液送回实验室，在显微镜下检出回收液中的胚胎，并按国际胚胎协会标准，鉴定胚胎发育及等级，将可用胚胎清洗后装入0.25 塑料胚胎细管进行鲜胚移植，剩余的A 级可用胚胎冷冻保存[5]。

1.5 数据统计与分析

试验数据用Excel 制作数据库，用SPASS12.0 进行分析检验。

2 结果与分析

2019 年7 月份， 在齐齐哈尔市畜牧园区牛场选择27 头和牛供体分五批进行超数排卵胚胎生产，共获得和牛胚胎274 枚，其中可用胚胎173 枚，平均可用胚每头6.4 枚，胚胎可用率63.1%，共胚胎移植124 头。

2.1 供体月龄对胚胎生产效率的影响

理论上应选择12 月龄以上的和牛作为胚胎生产供体，但因供体数量有限，本次被迫选用了部分12月龄以下接近12 月龄供体。从表1 可以看出，12 月龄以下平均胚胎数尚可，但标准差较大（7.18），说明该月龄段个体之间超排效果差异大，同时人员冲胚操作相对困难。 在供体数充足情况下，仍建议选用12 月龄以上供体超排，13 月龄样本数太少数据不具有代表性未做对比分析。

表1 不同月龄可用胚数比较

2.2 供体身高体重对胚胎生产效率的影响

通过对供体牛称重资料，根据体重数据分组，比较体重因素与出胚效果的相关性，从表2、表3 可以看出体重300 kg 以下或身高120 cm 的个体在特定的剂量下也可以达到较好的胚胎生产效果，与其他组差异显著（P ＞0.05）。所以供体牛选择并不是必须选择体重或身高数值大的，小个子、体重轻点并不一定出胚效果差。

表2 不同体重可用胚数比较

表3 不同身高可用胚数比较

2.3 公牛精液对胚胎生产的影响

本次胚胎生产供体牛超排配种共使用4 头和牛公牛细管冻精，为不同批次生产，各公牛系谱上标注繁殖力不同，且冻精各批次生产时间条件不同，解冻后精液质量存在一定差异，可能会对胚胎生产带来影响，为此，将4 头公牛所配种的供体母牛出胚数进行了对比（见表4）。 种公牛的细管精液的品质与生产胚胎的可用率呈正相关，活力好的精液配种后胚胎可用率较高，本批次试验显示差异显著（P ＞0.05）。

表4 不同公牛精液配种后生产可用胚数对比

2.4 埋栓时间对胚胎生产的影响

从胚胎采集结果表明，在选择供体青年和牛母牛时应选择卵巢上黄体有活性，有正常发情周期的供体青年和牛母牛为佳[6，7]，见表5，数据表明，在发情后5～11 d 埋置CIDR 栓均可以取得较好的效果，12 d以后效果不佳，差异显著（P ＞0.05），应避免在发情周期后期（12 d 后）放植CIDR 栓开始超排程序。

表5 发情后不同天数埋栓生产可用胚数对比

2.5 FSH 超排剂量对胚胎生产的影响

对超排的供体青年和牛按剂量分为四组，比较可用胚数，见表6，试验结果表明，剂量10 mL、11 mL 这两组均获得了较好的可用胚数，与12 mL、13 mL 组差异显著，考虑FSH 购入成本，对青年和牛使用10 mL 加拿大FSH 超排剂量是经济实惠的。

表6 不同FSH 剂量超排生产可用胚胎数对比

2.6 埋栓与PG 处理受体同期效果对比

受体牛群共280 头， 本次移植试验分别使用埋置进口CIDR 栓法和PG 一次注射法进行同期发情处理，观察到受体牛发情后，记录牛号，在第7 d 检查黄体，凡是黄体直径大于0.5 cm 的作为合格受体移植，最终完成移植124 头，同期方法发情效果比较见表7、图1，结果表明，埋栓法发情率、受体牛利用率高，但进口CIDR 栓较贵，因此不考虑成本的情况下采用放CIDR 栓方法处理受体发情率、可用率高。

表7 PG 与埋栓同期处理受体效果对比

2.7 胚胎移植移植受孕效果对比

共移植124 头受体，其中鲜胚移植受胎率为53%，冻胚移植受胎率为47%，不同操作人员移植受胎率差异很大，因样本移植头数差异过大，不做比较。根据实验数据，分别对同期方法、胚胎级别、胚龄、单双胚移植效果进行了对比，见图1、图2、图3、图4。

2.7.1 同期类别受孕率比较

自然发情的受体移植受胎率为36.30%，PG 同期处理的受体移植受胎率51.61%，CIDR 栓同期处理的受体移植受胎率率为53.19%，PG 组和CIDR 组差异不大，但以同期总受体牛数为基数对比，在齐齐哈尔市7 月份CIDR 的胚胎移植效率高于PG 处理组（见图1）。

图1 同期类别比较

2.7.2 胚胎级别受孕率比较

按国际通用胚胎鉴定标准，一级胚为胚胎形态完整，轮廓清晰，呈球形，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，没有附着的游离细胞和液泡或很少，变性细胞比例少于10%，二级胚胎轮廓清晰，色调及细胞密度良好，可见一些附着的游离细胞和液泡，变性细胞约占10%～30%[2]。 试验结果表明，一级胚胎移植受胎率（56.10%）显著高于二级胚胎（46.30）（见图2）。

图2 胚胎级别比较

2.7.3 不同胚龄受孕率比较

通常情况下，第7 d 采集胚胎，大部分的胚胎处于第4 发育期（致密桑葚胚）、第5 发育期（早期囊胚）、第6 发育期（囊胚阶段），也有少数处于第3 发育期（桑葚胚）、第7 发育期（扩张囊胚），本次试验数据表明：第5～7 期（即早期囊胚、囊胚、扩张囊胚）胚胎移植受孕率高，见图3，这可能与胚胎细胞数多有关。

图3 胚龄-受胎率比较

2.7.4 单胚、双胚移植受孕率比较

在试验中，有部分3 级胚胎（胚胎形态完整，但轮廓不清晰，结构松散，游离细胞及变性细胞比例超过30%，但仍有一团内细胞存活）。 冷冻没意义，丢弃可惜，如果单独进行鲜胚移植，还可能有1%～5%的几率怀孕，根据受体牛数量，我们把这样的3 级胚胎和二级搭配一起移植，因为是移植所产后代大部分仅作牛肉生产，不继续繁殖，所以不考虑双胎异性孪生不育问题，获得了一定的移植受胎率，经比较，发现多胚移植受孕率为55.93%，单胚移植受孕率为50.00%，差异明显（见图4），试验证明，在鲜胚移植时，二级单胚附加一个差的三级胚胎，可以显著提高移植受孕率十个百分点。 这与李延春主编的羊胚胎移植实用技术提到的肉羊胚胎双胚移植结论一致[13]。

图4 单头移植胚胎数比较

3 讨 论

3.1 夏季青年和牛供受体同期发情的方法

一般在繁殖季节进行家畜胚胎移植效果好于非繁殖季节，对牛而言，因为是全年发情大家畜，理论上全年都可进行胚胎移植操作，但在实际生产中，由于夏季炎热热应激，往往同期发情，胚胎移植效率不佳[8，9]，本试验数据也表明，7 月份自然发情率不高，使用PG 处理法效果也不理想，使用CIDR 埋置法人工控制发情周期效果较好，这与其他研究人员的结果一致[8]。

3.2 影响青年和牛采集胚胎效率的因素

虽然试验比较成功，各项数据表明12 月龄青年和牛进行超数排卵和胚胎移植获得较好的效果，但是和牛是小型肉牛品种，部分青年和牛只因为子宫过细，肛门狭窄，直肠油脂过多，造成胚胎采集操作困难，甚至放弃采集胚胎[10]，因此需要在筛选供体牛直肠检查时考虑淘汰子宫过细、肛门狭窄的供体母牛。 如果要成功完成青年牛胚胎移植工作，需要考虑以下因素[11,12]：

科学合理制定胚胎生产移植计划，包括供受体牛选择、FSH 剂量、超排程序、胚胎采集时间、器械采购与消毒准备等，保证稳定的、足够数量的、高质量的供体受体来源，供受体有准确的个体标记系统；

养殖场具有健全的畜群健康计划，包括检疫，疫苗接种，寄生虫治疗等；在超数排卵胚胎移植程序进行时，应避开检疫、接种疫苗、治疗等操作，会影响胚胎采集及移植效率。养殖场能严格执行供受体牛营养方案，保证供受体不过肥或过瘦，营养适度均衡。

技术人员认真负责，技术熟练，助手能准确监测和记录供受体牛的发情情况；

尽可能完善实验室必备设施，保证胚胎采集、操作、移植环境卫生无菌，温度变化不大。只有每个细节都严格把控，才能实现良好的青年和牛超数排卵和胚胎移植效果。

3.3 提高夏季和牛胚胎移植生产效率易忽略的因素

饲养与营养：供体受体母牛需要按照供受体牛营养方案确保能量、蛋白质、维生素和矿物质满足身体生长和繁殖机能发育，适度的粗蛋白水平，优质的青贮，适当长度的优质粗饲料TMR 将有助于提高母牛繁殖机能发育、增加胚胎生产移植的成功率和效率。 现有的供体青年和牛按照肉牛育肥前期营养配方进行饲喂，其饲喂目的和营养标准与繁殖母牛有很大差异，导致供体母牛繁殖机能发育迟缓，肠下脂肪积累过多，部分牛只因肛门紧无法操作从而无法使用，影响供体利用率和生产效果。

气候环境影响： 夏季天气炎热多雨，应特别注意和避免饲草料霉变，霉变饲草料、炎热的夏季造成和牛一定的热应激，采食量下降，发情减少，发情症状不明显等，对动物繁殖机能和冲胚效果有影响。

4 结 论

在夏季进行青年和牛进行超数排卵和胚胎移植生产可以取得较好的效果；12 月龄的青年和牛进行超数排卵可以获得满意的胚胎生产效果；体重300 kg 以下，身高120 cm 的个体在特定的剂量和供体选择下也可以达到较好的胚胎生产效果；健康的公牛所产的优质的精液是胚胎生产成功的重要因素；10 mL（200 mg）是青年和牛超排的适合剂量；在不考虑成本的条件下，埋置CIDR 栓同期发情效果好，鲜胚移植受胎率可以达到53%，冻胚移植受胎率达到47%。 成功完成青年和牛胚胎移植工作，需要考虑各方面因素，只有每个细节都严格把控，才能提高青年和牛超数排卵和胚胎移植效率。