超声波法提取沙棘叶黄酮的参数优化

2019-03-19刘艳丰唐淑珍王文奇王承敏

草食家畜 2019年6期

刘艳丰，唐淑珍，王文奇，王承敏

（新疆畜牧科学院饲料研究所，乌鲁木齐 830013）

沙棘生长具有耐寒冷、耐干旱和适应性强等特性，非常适宜新疆种植。现新疆的天然林面积、人工种植面积也在逐渐扩大[1]。沙棘的根、茎、叶都含黄酮，但以叶中含量最高[2]。黄酮有诸多生物活性和药理作用，如抗氧化和清除氧自由基，降低血糖、血脂、尿糖，增强机体的免疫因子和免疫系统等功效[3]。利用超声波法提取沙棘的活性物质，我国学者进行了大量的研究（孙天宇,2012[4]；金钟，2014[5]），但不同学者的方法各具特色，如何开发新疆沙棘资源，提取其黄酮尚未有相关论著。本试验选择含黄酮较多的沙棘叶进行超声波提取，同时对提取的不同影响因子进行比较，来考察超声波提取方法对沙棘黄酮提取率的影响。

1 材料和方法

1.1 试验原料及其预处理

试验原料：沙棘叶，取自新疆青河县沙棘连片种植区。将从沙棘树上剪下的嫩枝在阴凉处经过4～5 d阴干，每天多次翻晒，防止霉变。将枝条和杂物全部筛选干净后装袋，带回实验室，待用。

1.1.1 去脂参照Upendra 等(2008)[6]的方法进行。将经过挑选、整理、去刺的沙棘叶，在65 ℃下烘干，粉碎后过40目筛。在500 mL 烧杯中加入沙棘叶粉末30 g，加入150 mL 石油醚，室温状态下，浸泡1 h，提取低极性物质（油脂、色素等），极低性物质可能会影响黄酮的提取与测定。沙棘需要经过浸提除杂后，多次洗涤至滤液无色，常温干燥滤渣即为脱脂后沙棘叶粉末。

1.1.2 酶解

在500 mL 烧杯中加入去脂的沙棘叶粉末30 g，加90 mL 水浸泡，用盐酸调节pH=4，加入0.5%纤维素酶充分搅拌，置40 ℃恒温水浴保温1.5 h。洗涤数次，常温干燥滤渣即为酶解后沙棘叶粉末。

1.2 提取工艺

沙棘叶黄酮提取以乙醇体积分数、料液比、提取时间和超声功率为自变量，以沙棘叶黄酮含量为考察指标。准确称取经过去脂和酶解的5.000 g 沙棘叶粉末，小心放入250 mL 具塞三角瓶底部，加入相应的提取溶剂，搅拌均匀后，将三角瓶置于超声波仪中进行超声提取，提取完成后，将提取液过滤，浓缩至干，即得沙棘总黄酮。

1.3 沙棘黄酮含量的测定

1.3.1 单因素试验和优化

以沙棘叶为研究对象，以乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声功率为试验因子，以沙棘叶黄酮提取率为指标，通过单因素试验，确定沙棘叶黄酮提取的不同因素的最佳节点。在此基础上，以乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率等条件进行正交设计试验优化设计，见表1。

表1 超声波提取正交试验水平和因素

1.3.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响准确称取预处理后的沙棘叶粉1.000 g，放进具塞的三角瓶里，加入35 mL 的不同体积分数的乙醇溶液，体积分数为60%、65%、70%、75%、80%和85%的乙醇为提取溶剂，在温度40 ℃，超声功率100%的条件下超声30 min，然后过滤，滤液用氮吹仪吹干，用95%乙醇定容至50 mL，制成待测液，测定每次的吸光度值，每次重复做3 次平行试验。

1.3.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响准确称取预处理后沙棘叶1.000 g，放进具塞的三角瓶里，与75%的乙醇溶液混合，在温度40 ℃，超声功率100%，并在1：20、1：25、1：30、1：35、1：40 和1：45 的条件下，超声处理30 min，然后过滤，滤液用氮吹仪吹干，用95%乙醇定容至50 mL，制成待测液，测定每次的吸光度值，每次重复做3 个平行实验。

1.3.1.3 超声时间对总黄酮提取率的影响准确称取预处理后沙棘叶1.000 g，放进具塞的三角瓶里，加入75%的乙醇，并以1：35 的料液比混匀，在温度40 ℃，超声功率100%的条件下，分别提取20、25、30、35、40 和45 min，然后过滤，滤液用氮吹仪吹干，用95%乙醇定容至50 mL，制成待测液，测定每次的吸光度值，每次重复做3 次平行实验。

1.3.1.4 超声功率对总黄酮提取率的影响准确称取预处理后沙棘叶1.000 g，放进具塞的三角瓶里，与75%的乙醇溶液混合，在料液比为1：35，温度40 ℃，超声功率分别为50%、60%、70%、80%、90%和100%时，提取30 min，然后过滤，滤液用氮吹仪吹干，用95%乙醇定容至50 mL，制成待测液，测定每次的吸光度值，每次重复做3 个平行实验。

1.3.2 沙棘黄酮的超声波正交试验设计

选定乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率这4 个对超声提取影响显著的因子作为正交设计试验的测定因素，每个因素设立三个水平，按照正交试验的L43 进行设计如表1 所示。

1.3.3 标准曲线的制作

精确称量于120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品5.0 mg，用95%乙醇溶解后，定容至50 mL 容量瓶中，分别量取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 分装到6 个50 mL 容量瓶，每个容量瓶加入0.5 mL 1%的A1C13溶液(溶剂为95%乙醇)，用95%乙醇定容至刻度，在避光处静置10 min，用紫外分光光度计UV2000 在430 nm 处测定其吸光度。得出芦丁标准品的线性回归方程。

1.4 仪器和试剂

紫外可见分光光度仪UV2000(尤尼柯（上海）仪器有限公司生产)；恒温水浴锅B-260(上海亚荣生化仪器厂生产)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器制造厂生产)；所用乙醇、乙酸乙酯均为分析纯；芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)。

1.5 沙棘叶黄酮含量测定

将制备的沙棘叶黄酮溶解于95%乙醇中，加入1%A1C13（溶剂为乙醇）溶液0.5 mL，定容至50 mL 容量瓶中，以芦丁为标准品，利用紫外分光光度法测定。

计算式为R=cv*100%/m

式中V—定容体积，m—样品质量

2 结果和分析

2.1 标准曲线

在430 nm 吸收波长处，以芦丁为标准，AlCl3为显色剂，绘制芦丁标准溶液浓度与吸光度的标准曲线，回归方程结果为y=0.6341x-0.0115(见图1)。

图1 标准曲线图

2.2 乙醇体积分数的确定

不同乙醇体积分数提取沙棘叶黄酮的提取率如图2 所示。从图2 中可知，乙醇体积分数从60%增加到75%时，提取率显著提高（P＜0.05），从60%提取率0.72%提高到75%时的0.79%。但是，随乙醇体积分数的增加，提取率表现出下降的趋势（P＞0.05）。所以本试验以75%乙醇体积分数为最佳。

2.3 料液比的确定

不同料液比提取沙棘叶黄酮的提取率如图3 所示。从图3 中可以看出，随着料液比的降低，提取率表现为先升后降的趋势；当料液比达到1︰35（g/mL）时，提取率达到最高（P＜0.05）。为节省提取溶剂和成本，以1︰35（g/mL）的料液比为最佳。

2.4 超声时间的确定

不同超声时间提取沙棘叶黄酮的提取率如图4 所示。从图4 中可以看出，随着超声时间的延长，提取率显著增加，但在45 min 后增加速度趋缓。因此本试验选择提取时间为45 min 为超声时间节点。

2.5 超声波功率的确定

不同超声波功率提取沙棘叶黄酮的提取率如图5 所示。从图5 中可以看出，随着超声波功率的增加，黄酮提取率先增加后降低，在90%时达到最大，随后有所降低，但差异不显著（P＞0.05）。因此本试验以90%的超声波功率为最佳。

图2 乙醇体积分数的影响

图3 料液比的影响

图4 超声时间的影响

图5 超声功率的影响

2.6 超声优化正交实验

由表2 可知，不同因素及水平进行正交试验，结果为A3＞A2＞A1，B1＞B2＞B3，C2＞C1＞C3，D3＞D1＞D2，4个因素的优水平组合为A3B1C2D3 为本试验的最有水平组合，L43 由极差分析可得影响黄酮提取率的因素为：时间(A)＞超声功率(D)＞乙醇体积分数(C)＞固液比(B)。

表2 沙棘叶黄酮提取正交试验设计

续上表

3 讨论

纤维素酶的功能主要是破坏细胞壁的结构，释放出胞内物质；果胶酶释放细胞中果胶，果胶对黄酮的吸附性较强，所以在提取黄酮时，添加纤维素酶效果要好于果胶酶。纤维素酶还有一个作用是不破坏原料的活性成分[7]，对提取率有明显提高作用[8]。本试验在借鉴前人研究的基础上，添加了纤维素酶。

沙棘叶黄酮的提取方法主要有热水浸提、有机溶剂提取、微波辅助提取和超声波提取等方法和工艺(赵芙蓉,2012[9])。不同提取法相比较，超声波提取的优势有强化乙醇浸提，达到省时、高效、节能的目的(Riera,2004[10])。孙天宇等(2012)[4]研究也验证了这一观点，所以本试验采用超声波提取法。

在本试验条件下，从单因素看，75%乙醇浓度时，沙棘黄酮提取率较高。孙天宇（2012）[4]的研究也论证了这一点，在75%附近提取率较高，但本试验与孙天宇在75%以后的试验结果有差异，本试验在75%乙醇浓度继续增加乙醇浓度，提取率显著下降，可能是由于增加了酶解等不同的处理方法，导致高浓度乙醇溶液对沙棘中黄酮提取率产生影响，后续对条件进一步研究。从料液比来看，不同料液比的提取率呈现类似正态分布，在1：35 附近达到顶峰，随之下降，可能是随着添加的液体增加，物料的浓度降低，从而降低提取率。随着超声功率增加，沙棘黄酮提取率逐渐增加，但在90%时是一个拐点。超声强度与提取效率呈正比关系[11]。根据图5 表明，在50%～90%之间，提取率升高较明显，在高于90%时提取率略有下降，说明过高的超声功率对黄酮分子产生破坏作用，沙棘黄酮有所损失。