顾曙余 王士维 刘梅

摘  要：利用鼠胚传代培养细胞，制备细胞爬片，并分别运用考马斯亮蓝R250和FITC-鬼笔环肽来染色显示细胞微丝，探索和改进实验方法，以便有效观察细胞微丝的分布和形态结构。结果显示，采用鼠胚传代培养细胞作为实验材料，传代成纤维状细胞铺展良好，经固定、通透并染色后，可在普通光学显微镜和荧光显微镜下显示微丝束在细胞中的分布，既便于实验观察，也有助于学生对微丝骨架作用的理解和掌握。

关键词：微丝;细胞骨架;荧光显微镜

中图分类号 G642.0文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）（02-03）-0131-02

Abstract：In order to improve experimental methods of the cell microfilament observation experiments，mouse embryonic subcultured cells were used as experimental materials，and well passaged on the glass coverslips.After the cells were fixed and permeabilized，cell microfilaments were stained and displayed using Coomass R250 and FITC-Phalloidin respectively.The results showed that under the bright microscope and fluorescence microscope，the cell microfilaments can be displayed more clearly and effectively.It is easy for experimental observation and helps students understand the role of the microfilament cytoskeleton.

Key words：Microfilament;Cytoskeleton;Fluorescence microscope

在細胞内，微丝是由肌动蛋白分子螺旋状聚合形成的纤维丝，而肌动蛋白又以肌动蛋白单体（或称球状肌动蛋白，G-actin）或由单体组装而成的纤维状肌动蛋白（F-actin）多聚体2种形式存在。F-actin是由多个G-actin构成的长链纤维，2条F-actin反相平行结合成螺旋链，发挥生理功能。由微丝形成的微丝束又称为应力纤维，常横贯于细胞长轴。微丝对细胞贴附、铺展、运动、内吞、细胞分裂等许多细胞功能起着重要作用，而微丝又与微管、中间丝组成真核细胞中的三维纤维网络骨架体系，这些由蛋白质聚合而成的细胞骨架主要功能包括：调节细胞内容物的空间分布，介导细胞内外的信号转导，调节细胞运动及形态。研究表明，细胞骨架的结构受到多种细胞因子的调节，细胞骨架的改变也与一些疾病的发生密切相关[1]，如囊性纤维化肺这一慢性疾病除了受到相关基因调控外，还提示与诱导增加肌动蛋白的聚合，从而促进微丝束的形成相关[2]。

“动物细胞微丝的观察”是生物科学本科层次开设的实验必修项目之一，现有的教学实验参考指导书[3-5]，大多所列实验步骤较复杂，实验所用细胞及试剂材料无法购买，或在本科实验教学中显示效果不明显。近年来，笔者在细胞生物学实验教学中，利用鼠胚组织进行原代培养并成功传代培养形成的成纤维状细胞作为实验材料，开展了动物细胞骨架的标记及观察实验。实验分别采用非特异性蛋白质染料考马斯亮蓝，以及特异性荧光染料FITC-鬼笔环肽来标记染色，通过光学显微镜与荧光显微镜来观察微丝在细胞中的分布及形态特征。与考马斯亮蓝R250这一普通蛋白质染料不同，鬼笔环肽是从毒性菇类中分离的生物碱，它同细胞松弛素的作用相反，不与肌动蛋白单体分子结合，只与多聚体的F-actin结合，而用FITC或Rhodamin等荧光物质标记的鬼笔环肽可特异性的显示微丝骨架在细胞中的分布。

1 实验材料

实验细胞：小鼠鼠胚传代培养细胞（来源于本科学生培养的鼠胚组织原代培养细胞）。

实验试剂及器材：1640培养基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、PBS缓冲液、4%多聚甲醛、0.1%TritonX-100、0.25%考马斯亮蓝R250、5μg/mL的FITC-鬼笔环肽、5μg/mL Hochest33258、24孔培养板、24孔培养板用圆形细胞爬片（即圆形盖片，直径14mm）、parafilm封口膜。

2 实验方法

2.1 细胞爬片的制备 将生长良好的鼠胚传代培养细胞消化后，稀释细胞至104～105个/mL浓度。准备24孔培养板，每孔预先放入适量血清培养基，并放入无菌圆形爬片，细胞添加至圆形爬片上方。如不用24孔培养板，爬片也可放入无菌培养皿内进行细胞培养。37℃，5%CO2条件下继续进行细胞培养。

2.2 细胞的固定及通透 24h后，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，标记生长良好的培养孔，吸去培养基，用37℃预温PBS轻轻清洗细胞3次，快速洗去残留的培养基及血清。加入4%的多聚甲醛固定20min，吸去固定液，再用PBS清洗细胞3次。加入0.1%TritonX-100处理20～30min，继续用PBS清洗细胞3次。小心取出在24孔培养板内培养有鼠胚传代培养细胞的盖片，略晾干后，进行后续的染色实验。

2.3 制片及染色方法 首先，在2片封口膜上分别滴加0.25%考马斯亮蓝R2505μL和5μg/mL的FITC-鬼笔环肽5μL。取出处理过的细胞爬片倒扣在膜上室温避光染色40min（即细胞面朝下反扣在预加染色液的膜上），夏季时间可以短一些。染色完成后用PBS轻缓冲洗清洗细胞3次，洗去多余的染液。考马斯亮蓝染色的细胞爬片，可待爬片稍晾干后，直接放于载玻片上用普通光学显微镜在白光下观察。而用FITC-鬼笔环肽染色的细胞爬片，继续倒扣在5μg/mLHochest33258染液中染色细胞5～10min，用PBS清洗细胞3次后，细胞爬片也同样放在载玻片上，用荧光显微镜观察。

2.4 普通光学显微及荧光显微镜的观察 染色细胞爬片均运用Olympus BX41显微镜观察，40倍物镜下已能清晰观察到铺展良好的成纤维状鼠胚传代培养细胞，用DP70摄像头进行显微拍摄，并用Image Pro Plus 5.0（IPP）软件对所有显微照片进行标尺标记，双荧光图片则使用IPP软件进行荧光照片的拼合。

3 结果与分析

3.1 考马斯亮蓝R250染色效果 运用普通光学显微镜在白光下观察，鼠胚传代成纤维状细胞的生长分裂旺盛，细胞铺展好，形态舒展并有较多的细胞附着在盖玻片上，可清晰观察到考马斯亮蓝染色的鼠胚细胞胞体突出丰富，立体感强，不仅可见染成浅蓝色纵贯细胞轴的微丝，还可见染成深蓝色的细胞核。

3.2 双荧光染料染色效果 用FITC-鬼笔环肽与Hochest33258双荧光染色的細胞，用紫外光激发，则细胞核产生明亮的蓝色荧光，而用蓝光激发，微丝则产生清晰的绿色荧光。用IPP软件拼合标记细胞核及微丝。

4 结论

在“动物细胞微丝的观察”教学实验中，我们运用考马斯亮蓝R250和FITC-鬼笔环肽对微丝进行对照标记显示。考马斯亮蓝并不能够特异性地显示细胞微丝的分布，是利用Triton X-100处理细胞后可以脱除不稳定的非骨架蛋白，而结构稳定的微丝蛋白仍能保留下来染色显示。而用FITC荧光物质标记的鬼笔环肽可特异性的显示微丝骨架在细胞中的分布，在本实验中显示效果好，荧光清晰，染色对比明显，有助于学生对细胞微丝理解和掌握。

细胞生物学实验是一门单独设课的实验课程，实验课只在每周固定时间段开设，学生无法连续进行实验。近年来，通过多次试验、反复摸索和研究，形成了从鼠胚原代培养、传代培养、细胞活性观察、细胞骨架染色显示及运用CCK8法检测细胞增殖这一系列可每周单独设课的连续实验内容。其中“动物细胞微丝的观察”这一实验项目，根据实验设计，实验从已制备好的细胞爬片开始，到最后完成细胞微丝的显微观察大约需要4个学时。微丝显示效果好，学生参与度高，取得了很好的教学效果。

参考文献

[1]陈业成，赵洪文.细胞骨架与肿瘤之间的关系研究进展[J].国际呼吸杂志，2018（12）：933-936.

[2]Corvol H，Rousselet N，Thompson K E，et al.FAM13A is a modifier gene of cystic fibrosis lung phenotype regulating rhoa activity，actin cytoskeleton dynamics and epithelial-mesenchymal transition[J].Journal of Cystic Fibrosis，2018，17（2）：190-203.

[3]李素文.细胞生物学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2001.

[4]丁明孝，苏都莫日根，王喜忠，等.细胞生物学实验教程[M].北京：高等教育出版社，2013.

[5]桑建利，谭信.细胞生物学实验指导[M].北京：科学出版社，2010.

（责编：张宏民）