王占营 冀含乐 王二强

摘  要：该文综述了牡丹研究中分子标记技术应用的主要内容和进展，主要包括牡丹遗传多样性分析，指纹图谱构建，早期杂种鉴定和基因定位等方面的应用。并且分析了此研究领域目前存在的问题，展望了牡丹分子育种的前景。

关键词：分子标记技术;牡丹;应用与前景展望

中图分类号 S685.11文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）（02-03）-0010-03

Abstract：The main contents and progress of molecular technology in peony research are reviewed in this paper.The main applications include molecular marker technology in peony genetic diversity analysis，fingerprint mapping construction，early hybrid identification and gene mapping.The current problems in this research field are pointed out，and the application of peony molecular breeding is prospected.

Key words：Molecular marker technology;Peony;Application and prospects

1 引言

分子标记是基于核酸分子多态性的遗传标记，其直接反映了脱氧核糖核酸（DNA）分子水平的遗传变异。相对于传统的遗传标记，如形态标记、细胞学标记和生化标记，分子標记具有许多优点，如标记的数量多，多态性高，分布广，中性，无环境限制等[1-2]。DNA分子标记及其相关的主要分子技术有：（1）基于Southern杂交的标记，如 RFLP、SSCP-RFLP和DGGE-RFLP;（2）基于PCR的标记，如RAPD、AFLP、TRAP、SPAR等;（3）基于重复序列的标记，如SSR、SSLP、微卫星DNA等;（4）mRNA为基础的标记，如RT-PCR、EST、SAGE等;（5）单核苷酸多态性为基础的标记，如SNP[3]。牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.），为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia L.）落叶灌木，是中国的传统名花[4]。目前，国内外对牡丹的研究，除了传统的育种改良，各种牡丹生物学特性和栽培种植等之外，随着分子标记技术的发展和广泛运用，利用分子技术的牡丹遗传多样性分析、指纹图谱分析、早期杂种鉴定和基因定位等研究工作也逐步深入。本文简述了当前分子标记在牡丹各方面的研究进展。

2 分子标记技术在牡丹研究中的应用

2.1 遗传多样性分析 中国牡丹资源丰富，种类繁多，研究分析牡丹遗传背景对牡丹资源保护和杂交育种工作具有重要意义。1994年，裴颜龙等利用10对随机引物扩增出了矮牡丹和紫斑牡丹的基因组DNA，DNA条带的多态性反应出了牡丹种群间和种群内的遗传差异，证实了RAPD技术可用于牡丹遗传多样性分析[5]。随后，研究人员分别利用RAPD、AFLP和SRAP等分子标记技术分析了不同花色、不同株高和不同花型的牡丹品种的基因组DNA多态性，研究牡丹品种之间的亲缘关系[6-8]。李保印等将牡丹的农艺表型性状与2种分子标记ISSR、AFLP结合起来，构建了中原牡丹品种核心种质资源库[9]。之后，研究者们分别利用ISSR、SSR、SRAP、CDDP标记方法分析滇牡丹、紫斑牡丹、大花黄牡丹、菏泽牡丹和不同牡丹品种群的遗传多样性[10-15]，为牡丹品种资源保护、利用以及新品种选育提供分子生物学依据。综上所述，利用分子标记技术研究牡丹的遗传多样性，主要体现在亲缘关系分析、核心种质库构建、野生资源评价和品种起源等方面。

2.2 指纹图谱的构建 目前牡丹栽培品种有2000多种，不同品种的从形态上鉴别非常困难，因为有的品种直接差异非常小，而且开花情况还受到地理、气候等影响，同一品种不同环境下表现也不完全一致。而利用分子标记技术来鉴定品种可以避开这些问题。以DNA分子标记为基础的DNA电泳图谱能够鉴别生物个体之间的差异，在鉴定品种中具有高效、准确的优点[16]。因其如同人类指纹一样识别不同的牡丹品种，也称指纹图谱。已有研究者通过构建牡丹品种的指纹图谱来鉴定识别不同的牡丹品种，其中包括不同牡丹品种群和芍药品种。其中用到的分子标记有荧光AFLP分子标记、SRAP、EST-SSR和ISSR分子标记技术等[17-21]。基于分子标记技术的DNA指纹图谱，弥补了形态学分类的缺陷，可有效地推动牡丹品种的鉴定和保护。

2.3 杂种早期鉴定 牡丹属于落叶灌木，从1粒种子到稳定开花至少需要3～4年的时间，杂交育种周期很长，并且杂交后存在真假杂交种子的问题，这是传统的杂交育种面临的问题。而利用分子标记技术，使杂种的早期鉴定和分子辅助育种成为可能。目前，SRAP、AFLP、SSR等标记技术已用于牡丹杂交种的早期鉴定以及杂交后代与亲本间的遗传关系[22-27]。这些研究，充分证明了分子标记技术在杂交鉴定中的可靠性和优越性。

2.4 基因定位 观赏牡丹新品种的选育点在花期，牡丹花期短暂，单朵花期约7～10d，群体花期集中，非常不利于牡丹观赏以及整个牡丹产业的发展。目前，观赏牡丹的育种方向重点在花色、花期、鲜切花寿命的改良调控。乙烯是影响器官衰老的重要生理因素，其对延长牡丹花期和鲜切花的寿命非常重要[28]，目前通过克隆合成乙烯的关键酶（ACC氧化酶）基因的部分序列，构建该基因的反义载体可以抑制乙烯的合成[29]。利用RT-PCR和RACE技术克隆牡丹鲜切花花瓣中ACO基因，序列分析表明，ACO基因对牡丹切花的开放衰老具有调节作用[30]。另外，有研究人员采用RT-PCR技术，克隆出2个控制牡丹长日照途径诱导成花的关键基因PsCO、PsFT 以及1个PsFT的下游调控基因PsSOC1[31]。2015年，蔡长福利用简化基因组测序技术SLAP-seq（Specific-locus amplified fragment sequencing）和简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）分子标记技术构建牡丹高密度遗传连锁图谱，定位牡丹重要表型性状的数量性状位点（Quantitative trait loci，QTLs）[32]。周华利用分子生物学方法分析比较二次开花和一次开花牡丹成花过程中与开花时间相关基因的表达差异[33]。2018年，侯小改等利用转录组BSA关联分析，定位到牡丹花期控制基因[34]。这一系列牡丹相关基因的定位，为未来利用分子手段改良牡丹性状奠定了基础。

3 问题与展望

3.1 问题 分子标记技术已逐渐应用于牡丹品种的遗传多样性研究、指纹图谱构建和品种鉴定等方面。目前存在的问题是：一是分子标记成本普遍较高，随着测序技术的不断发展，需要大幅度降低测序成本;二是当前牡丹分子生物学的研究基础仍相对薄弱，需要更多的研究人员共同努力以推进牡丹分子研究，为牡丹资源保护，品种改良和新品种培育打好基础;三是我国牡丹组织培养技术还不够成熟，在牡丹组培苗生根和移栽方面仍存在一定的问题。这些都是牡丹分子育种中的难点，严重阻碍了牡丹分子育种进程，同时也是目前牡丹分子育种的瓶颈，尚需研究人员共同努力克服，以加快牡丹分子育种进程。

3.2 展望 （1）分子标记辅助育种：通过牡丹全基因组测序获得一些重要经济性状的分子标记，对牡丹杂交育种后代中目的基因进行定向选择，加速牡丹新品种选育进程。（2）转基因育种：成熟的组培技术是转基因育种的基本，通过功能验证的目的靶基因，利用农杆菌介导的遗传转化方法，转化到牡丹愈伤组织中，经过组织再生体系，可在短时间内获得优良的花型、花色、花期以及抗性等重要农艺性状，缩短育种时间。（3）分子设计育种：利用牡丹全基因组图谱，基于基因编辑技术，对目标基因的进行定点突变，实现牡丹重要农艺性状的分子设计及新品种培育，对未来的牡丹育种研究将起到极大的推动作用。

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（责编：张宏民）