刘红云 扶胜兰 乔新荣 张艳玲

摘  要：研究猫爪草地上部和种子的体外抗氧化活性和成分含量，为充分利用猫爪草资源提供理论依据。结果表明，猫爪草地上部和种子的水提液具有一定的清除DPPH自由基、ABTS自由基活性及总还原能力。清除DPPH自由基的IC50值，地上部为0.57mg/mL，种子为4.95mg/mL;清除ABTS自由基的IC50值，地上部为0.614mg/mL、种子为1.06mg/mL。地上部的多糖含量（48.94mg/g）高于种子的（37.72mg/g），种子的蛋白质含量（14.48mg/g）高于地上部的（3.59mg/g）。猫爪草非药用部位具有一定的抗氧化活性，且地上部的抗氧化活性高于种子，这与地上部的多糖含量较高有关。

关键词：猫爪草;地上部;种子;水提液;抗氧化;成分

中图分类号 R285文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）（02-03）-0012-04

Abstract：The antioxidant activity and main components on aerial parts and seeds of Ranunculus ternatus Thunb were studied for the aim to provide the theoretical basis for further development and utilization of its non-medicinal resources.The results indicated that the water extracts from the aerial parts and seeds of Ranunculus ternatus Thunb showed certain activity of scavenging DPPH radical，ABTS radical and the reducing power.The IC50 value of DPPH scavenging activity was 0.57mg/mL in the aerial parts of Ranunculus ternatus Thunb，and 4.95mg/mL in its seeds.The IC50 values of ABTS scavenging activity were 0.614mg/mL，1.06mg/mL respectively.The polysaccharide content was 48.94mg/g in the aerial parts of Ranunculus ternatus Thunb and 37.72mg/g in its seeds.Conversely，the proteins contents of aerial parts in Ranunculus ternatus Thunb was 3.59mg/g，lower than the seeds（14.48mg/g）.Consequently，the non-medicinal parts of Ranunculus ternatus Thunb showed certain antioxidant activity，and its becoming strength with the increase of water extracts concentractions of Ranunculus ternatus Thunb.The higher antioxidant activity of aerial parts of Ranunculus ternatus Thunb was related to its higher polysaccharide content.

Key words：Ranunculus ternatu;the aerial parts;Seeds;Water extracts;Antioxidant activity;Components

貓爪草（Radix Ranunculi Ternati）系毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）的干燥块根，别名三散草、鸭脚板、金花草，主产于河南信阳地区，在我国其他地区也有分布[1]。其名始见于《中药材手册》，《中国药典》1995年将其收载。猫爪草性味甘、辛，性平，归肝、肺经，具有清热解毒、软坚化痰、散结消肿、截疟的功能[2]，主要用于治疗瘰疬痰咳，疔疮肿毒，蛇虫炎等症[3，4]。有研究表明，猫爪草多糖为其主要活性成分[5，6]，具有重要的生物活性[6，7]，尤其是体外抗氧化活性[8]。目前，对猫爪草的研究主要集中在块根部位，也有研究表明猫爪草全草均可入药[9]。本研究以猫爪草地上部分和种子为实验对象，对其水提液体外抗氧化活性和成分进行了测定分析，旨在为充分利用猫爪草资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 猫爪草地上部（猫爪草块根收获期采集）和猫爪草种子（经信阳农林学院周巍副教授鉴定），均于2016年5月采自河南省信阳市淮滨县王岗村猫爪草种植基地。去除杂质，阴干，60℃鼓风干燥至恒重，粉碎（80目）保存备用。

1.2 试剂 1，1-二苯基-2-三硝基苦肼（DPPH），购自Wako;2，2-联氨-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS），购自Sigma公司;石油醚（浙江中星化工试剂有限公司），无水乙醇（杭州龙山精细化工有限公司）;抗坏血酸、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、苯酚、葡萄糖标准品、冰乙酸、硫脲、邻甲苯胺、考马斯亮蓝、牛血清蛋白等试剂，均购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 仪器 JP-500B-2型多功能粉碎机（上海市久品工贸有限公司），DK-S24型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司），T6-紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），CP225D型1/10万电子分析天平（德国SATORIO 公司），202-2A数显电热恒温干燥箱（杭州蓝天化验仪器厂），Direct-Q3超纯水机（美国Milipore）等。

1.4 方法

1.4.1 样品提取液的制备 精密称取猫爪草地上部和种子粉末1.000g于圆底烧瓶中，加10倍量的石油醚（沸程60～90℃）回流提取2h，待残渣挥干溶剂后，加入150mL蒸馏水，于95℃下水浴回流提取2h、过滤，用热蒸馏水润洗残渣，定容至200mL，得5mg/mL的水提液，然后置于4℃冰箱保存备用。取2.5mL样品提取液于离心管中，2倍稀释成0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5mg/mL 5种浓度的溶液，用于抗氧化活性的测定。将阳性对照品Vc配制成5mg/mL母液，依据相应测定項目稀释至不同浓度。

1.4.2 DPPH自由基清除活性的测定 取不同浓度的样品提取液及Vc阳性标准品1mL加入3mLDPPH（0.1mmol/L）混匀后，37℃下静置30min的，于517nm测其吸光值（OD517）[10]，记为As。同时测定1mL样品提取液和Vc阳性对照品加3mL无水乙醇测OD517，记为A0;无水乙醇加3mL DPPH的OD517，记为Ac。计算样品和Vc阳性标准品对DPPH自由基的清除率。计算公式如下：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（AS-A0）/AC]×100

1.4.3 ABTS自由基清除率的测定[11] 称取ABTS样品20.3mg，溶于5mL的蒸馏水中，配制成7.4mmol/LABTS储备液;称取过硫酸钾3.51mg，溶于5mL的蒸馏水中，配制成2.6mmol/L储备液;混合之后，在室温、避光条件下静置12～16h。取1mL的混合液，加40mL的磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH6.6），使得在734nm下的吸光度为0.7±0.005。分别取不同浓度的样品提取液和Vc1mL加入4mLABTS混匀后，室温静置5min后测定吸光值。清除率计算方法同1.4.1。

1.4.4 总还原能力的测定[12] 取不同浓度的样品提取液2.5mL，加2.5mL磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH6.6）和2.5mL1%K3Fe（CN）6，50水浴保温20min，快速冷却后加入2.5mL的10%三氯乙酸，3000r/min离心10min，取上清液2.5mL加2.0mL蒸馏水、0.5mL的0.1%FeCI3，静置10min，700nm测吸光值。吸光值越大，表示还原力越强。

1.4.5 样品提取液成分含量测定[13]

1.4.5.1 多糖 采用O-T试剂法测定多糖含量。标准溶液配制精密称取干燥恒重的葡萄糖0.0502g，加蒸馏水定容到50mL。O-T试剂配制：250mL冰乙酸中加入0.4002g硫脲，15mL邻甲苯胺混合，至硫脲完全溶解，加入饱和硼酸10mL，置棕色瓶中，室温保存24h后使用。标准曲线的绘制：精取葡萄糖对照液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别于干燥具塞试管中，补加蒸馏水至1.0mL，分别加入O-T试剂5.0mL，沸水浴30min，冷水冷却，于630nm测吸光值A，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=0.138027X+0.007673，R2=0.996，在0.2～1.0mg范围内线性良好。精取提取液各2.0mL，各加80%的乙醇8.0mL，静置5min，离心吸取上清液，常压过滤沉淀，再重复操作4次，挥干溶剂，残渣蒸馏水溶解，加活性炭搅匀脱色，抽滤，定容到10mL，稀释1倍，从中各取1.0mL，装入具塞试管中，加O-T试剂5mL，沸水浴30min，冷水冷却，以试剂空白调0，测定630nm吸光度计算多糖含量。

1.4.5.2 蛋白质 采取UV法测定蛋白质含量。标准曲线的绘制：分别吸取5mg/mL牛血清蛋白标准液0、0.5、1.5、1.5、2.0、2.5和3mL于10mL的具塞刻度试管中，用重蒸水补齐至3mL，扫描紫外吸收光谱，测定280nm的吸光度（A），以质量浓度绘制标准曲线，得回归方程：A=0.1129x+0.0025，R2=0.9996，n=6。吸取样品提取液适量代替蛋白质标准液3mL，活性炭脱色，测定280nm的吸光度计算蛋白质含量。

1.4.6 IC50的计算 IC50指自由基清除率为50%时样品的浓度。以提取液浓度为自变量，清除率为因变量进行曲线拟合，根据拟合方程计算。

2 结果与分析

2.1 猫爪草地上部分和种子的水提液对DPPH自由基的清除率 抗氧化剂能够清除DPPH自由基归因于其提供质子的能力。猫爪草地上部和种子的水提液能很好地清除DPPH自由基，且清除率随质量浓度的升高而增大。虽然在相同质量浓度下，对DPPH自由基的清除率从小到大依次为：种子<地上部分地上部（0.57mg/mL）>种子4.95mg/mL。

2.2 猫爪草地上部和种子的水提液对ABTS自由基的清除能力 猫爪草地上部和种子的水提液具有一定的清除ABTS自由基能力，在供试样品质量浓度范围内，猫爪草地上部对ABTS自由基的清除能力高于猫爪草种子水提液。猫爪草地上部和种子的水提液对ABTS自由基的IC50分别为0.614mg/mL和1.06mg/mL。

2.3 猫爪草地上部和种子的水提液的总还原能力 一种物质的还原力大小可以反映其潜在抗氧化性能力。随着质量浓度的增大，猫爪草地上部和种子的水提液的总还原力逐渐增强，在相同质量浓度下其还原力大小顺序为：Vc>地上部>种子。

2.4 猫爪草地上部和种子的水提液的成分含量 地上部多糖含量高于种子中的多糖含量，但是种子中含有较高的蛋白质，为14.48mg/g;而猫爪草地上部蛋白质含量仅为3.59mg/g。

3 讨论

3.1 猫爪草地上部和种子的水提液的抗氧化活性 药用植物的采收过程是中药材生产的重要环节，也是实施中药资源综合利用的途径之一。传统中药材在采收过程只取其某一部分，其余部分均废弃，这不仅不利于中药资源的综合利用，还造成了资源浪费和环境污染[14]。大量研究表明[15-18]：药用植物的非药用部位具有多种药用成分和较强的生物活性，尤其是抗氧化活性。本研究结果表明，猫爪草地上部和种子的水提液均具有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力與浓度相关。

3.2 猫爪草地上部和种子的水提液的成分含量 有研究表明，猫爪草多糖为猫爪草药材主要活性成分[5，6]，不同产地猫爪草多糖含量差异显著，其中以河南产猫爪草多糖含量较高[19]。猫爪草多糖具有较强的生物活性，如体外抗氧化[8]、抗肿瘤[7，20]、免疫调节[5，6]等。本研究结果显示，猫爪草地上部和种子亦含有一定的多糖，猫爪草地上部为48.9mg/g，猫爪草种子为37.3mg/g。猫爪草多糖具有抗氧化活性，有一定的还原能力、较强的清除·OH和抑制O·的能力。猫爪草地上部的抗氧化活性高于种子，可能与猫爪草地上部的多糖含量较高有关。

4 结论

依据体外抗氧化活性和成分含量的测定结果，猫爪草地上部和种子的水提液均具有一定的抗氧化活性和活性成分。该研究结果可为充分利用猫爪草资源提供理论依据。

参考文献

[1]刘菊，王君明，纪彬，等.猫爪草粗多糖提取工艺研究[J].中医学报，2012，27（12）：1622-1623.

[2]李瑞，尹春萍.中药猫爪草的研究进展[J].中国药师，2014，17（3）：489-492.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2015.

[4]熊英，邓可众，高文远，等.中药材猫爪草化学成分的研究[J].中国中药杂志，2008，33（8）：909-911.

[5]张振凌，吴筱菁，王磊，等.中药猫爪草有效部位的免疫活性部位研究[J].中华中医药杂志，2007，22（2）：120-122.

[6]张振凌，吴筱菁，王磊，等.中药猫爪草多糖的免疫活性研究[J].时珍国医国药，2007，18（3）：537.

[7]王爱武，王梅，袁久荣，等.猫爪草提取物体外抗肿瘤作用的研究[J].天然产物研究与开发，2004，16（6）：529-531.

[8]吕小华，王会敏，韩红霞，等.猫爪草多糖免疫调节及抗氧化活性研究[J].中国中药杂志，2010，35（14）：1862-1865.

[9]冯艺萍.猫爪草的实验研究进展[J].内蒙古中医药，2014，33（7）：113-115.

[10]焦士蓉，马力，黄承钰，等.枳实提取物的体外抗氧化作用研究[J].中药材，2008：31（1）：113-116.

[11]靳玉红，李志西，乔艳霞，等.红枣乳酸发酵饮料的抗氧化活性[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2016，44（1）：199-205.

[12]徐大量，林辉，李盛青，等.玉竹水提液体外抗氧化的实验研究[J].中药材，2008，31（5）：729-731.

[13]贾慧青，范智超，薛生全.猫爪草多糖及蛋白质含量测定[J].时珍国医国药，2006，17（5）：736-737.

[14]丁安伟，王振月.中药资源综合利用与产品开发[M].北京：中国中医药出版社，2013：4-5.

[15]肖家军，王云，戴仕奎，等.苍耳叶挥发油的提取及抑菌和抗氧化性研究[J].食品工业科技，2011，32（7）：115-118.

[16]任东春，杨念云，钱士辉，等.川芎地上部位化学成分研究[J].中国中药杂志，2007，32（14）：1418-1420.

[17]朱玲英，段金廒，沈红，等.菊花、茎、叶中黄酮类化合物的测定[J].中成药，2007（5）：781-783.

[18]钱大玮，朱玲英，段金廒，等.不同生长期菊茎叶中黄酮类成分的动态变化[J].中草药，2009，40（8）：1317-1319.

[19]王爱武，袁久荣，吴丽敏.不同产地猫爪草多糖含量的比较[J].中国中医药信息杂志，2005，12（1）：51-52.

[20]Niu L，Zhou Y，Sun B，et al.Inhibitory effect of saponins and polysaccharides from Radix Ranunculi Ternati on human gastric cancer BGC823 cells[J].Afr J Tradit Complement Altern Med，2013，10（3）：561-566.

（责编：张宏民）