鲁 宏 宋 俊 孟京红 李 俊

(湖北文理学院附属医院骨科,襄阳441000)

骨关节炎是一种与软骨及其周围组织有关的常见的慢性退行性关节疾病，其进展通常较缓慢。骨关节炎患者在髋部和膝部的运动过程中往往会产生很大的负担，这些大型负重关节的疼痛和僵硬往往会导致严重的残疾，最后需要进行外科手术来治疗[1]。随着预期寿命的增加，骨关节炎的发病率将不断上升。骨关节炎严重影响患者的生活质量，并伴随着巨大的医疗保健和社会经济成本。据统计，在中国香港和加拿大骨关节炎患者每年的直接花费分别为9 147美元和2 878美元，间接花费分别为864美元和9 847美元[2]。开发新的有效的骨关节炎治疗方法对医疗卫生健康系统和社会经济具有重要意义。许多植物在骨关节炎的治疗方面发挥着积极作用，如紫草、甘菊蓝、接骨木及洋甘菊等[3,4]。香叶木素(Diosmetin,Diosm)(化学结构式见图1 )发现于金合欢树荚果和橄榄树叶，具有抗癌、杀菌及抗氧化等活性[5]。但目前关于香叶木素在骨关节炎中的作用研究还十分有限。本文主要目的是研究香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞免疫反应的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药物 香叶木素购自北京索莱宝科技有限公司，货号与规格： SD8390-20 mg，HPLC ≥98%，用DMSO配制成20 μmol/L。IL-1β来源于Sigma公司，货号与规格： SPR3083-10 μg，HPLC ≥98%，用PBS配制成50 ng/ml。

1.1.2动物及细胞分组 SD大鼠(出生5 d)购自中国科学院实验动物中心。软骨细胞分为4组：对照组，香叶木素组，IL-1β模型组，Diosm+IL-1β处理组。IL-1β模型组和Diosm+IL-1β处理组用IL-1β(50 ng/ml)处理1 h后进行换液，香叶木素组和Diosm+IL-1β处理组用含香叶木素(20 μmol/L)的培养液处理48 h；对照组用含DMSO的培养液处理。

图1 香叶木素化学结构式

1.1.3试剂 DMEM-F12培养基(Thermo Fisher Scientific,11320-033)。胎牛血清(Thermo Fisher Science,10099158)。细胞凋亡检测试剂盒Annexin V Apoptosis Detection Kit(BD Pharmingen,556547)。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的ELISA检测试剂盒(MSK,69-98069)。一氧化氮(Nitric oxide,NO)的ELISA检测试剂盒(MSK,69-20148)。前列腺素E2(Prostaglandin E 2,PGE2)的ELISA检测试剂盒(MSK,69-80119)。抗Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)(Abcam,ab34712)抗体。抗基质金属蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase 13,MMP-13)(Abcam,ab39012)抗体。抗蛋白聚糖(Abcam,ab2501)抗体。抗NF-κB P65(Abcam,ab16502)抗体。抗p-NF-κB P65(Abcam,ab86299)抗体。

1.2方法

1.2.1软骨细胞原代培养 新生颈椎脱臼处死后，无菌条件下取出膝关节剥离软骨组织，剪碎至0.5～1 mm3，PBS清洗后离心，1 000 r/min,5 min。再加入0.25%的胰酶37℃消化1 h后离心，1 000 r/min,5 min。去上清，加入含5%胎牛血清的0.2%Ⅱ型胶原酶37℃消化4～5 h。200目筛网过滤后离心，1 000 r/min,5 min。去上清，PBS清洗后加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基制成1×105个/ml 单细胞悬液。置于37℃，5%CO2培养箱中培养72 h后更换培养液。按照细胞分组用IL-1β 和香叶木素处理细胞后观察细胞形态并统计细胞数量。对照组细胞增殖率设置为100%。其他各处理组细胞增殖率=(处理组实验终点的细胞数-处理组初始培养的细胞数)/(对照组实验终点的细胞数-对照组初始培养的细胞数)×100%。

1.2.2流式细胞术检测细胞凋亡 首先将待测细胞用1×的Binding buffer制成1×106个/ml的悬液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min。最后利用流式细胞仪对染色的细胞进行检测。

1.2.3蛋白印迹 用PBS将待测细胞清洗3次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，100℃变性5 min。等量蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜，5%的BSA封闭1 h，再加入相应的一抗，4℃过夜孵育，第2天加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.2.4酶联免疫吸附实验(ELISA) 收集各组细胞培养物上清，按照ELISA试剂盒说明书进行检测，首先样品加入反应孔后37℃孵育45 min，洗涤液洗涤后加入生物素标记的抗体37℃反应30 min。然后加链霉亲和素-HRP 混匀37℃反应30 min，再加入显色剂避光显色15 min。最后加终止液终止反应，450 nm处检测吸光值。

1.2.5免疫荧光 当各组待测细胞长至80%时弃去培养液，PBS洗2次后用4%的多聚甲醛固定10 min。PBS洗3次后用0.3%的triton-100通透10 min。PBS漂洗3次进行封闭，然后加入相应的一抗37℃孵育1.5 h，PBS漂洗后加入对应的二抗，37℃孵育45 min。滴加DAPI后指甲油封片。荧光显微镜下观察拍照。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞形态和数目的影响 倒置显微镜下观察到，对照组和香叶木素组细胞形态正常，呈长梭状，十分密集；IL-1β组细胞形态出现异常，呈扁平状，十分稀疏；Diosm+IL-1β组细胞形态恢复正常，呈长梭状，较密集(图2A)。由图2B可知，对照组和香叶木素组细胞数目无明显差异。IL-1β组细胞数目明显低于对照组(P<0.05)。Diosm+IL-1β组细胞数目明显多于IL-1β组(P<0.05)。由此可见，香叶木素可改善IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞变形及细胞数目的下降。

图2 IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞形态(A)及细胞增殖率(B)

2.2香叶木素可降低IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡增加 流式细胞术分析香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡的影响。如图3所示，对照组和香叶木素组细胞凋亡率无明显差异。IL-1β组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。与IL-1β组相比，Diosm+IL-1β组细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。上述结果表明，香叶木素会抑制IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡的增加。

2.3香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞外基质的影响 通过蛋白印迹检测Ⅱ型胶原、MMP-13和蛋白聚糖蛋白水平，分析香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞外基质的影响。图4显示，IL-1β组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖蛋白水平明显低于对照组，MMP-13 蛋白水平明显高于对照组(P<0.05)。与IL-1β组相比，Diosm+IL-1β组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖蛋白水平明显升高，MMP-13 蛋白水平明显降低(P<0.05)。以上结果说明，香叶木素可减弱IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖蛋白水平的降低和MMP-13 蛋白水平的升高。

图3 流式细胞术检测细胞凋亡

图4 蛋白印迹检测细胞外基质相关蛋白表达

图5 ELISA检测炎症因子水平

图6 蛋白印迹检测NF-κB通路相关蛋白水平

2.4香叶木素可减弱IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞炎症反应的升高 利用ELISA检测IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞NO、PGE2和TNF-α水平，分析香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞炎症反应的影响。由图5可知，IL-1β组NO、PGE2和TNF-α水平明显高于对照组(P<0.05)。Diosm+IL-1β组NO、PGE2和TNF-α水平明显低于IL-1β组(P<0.05)。由此可见，香叶木素会抑制IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞NO、PGE2和TNF-α的上升，减轻炎症反应。

2.5香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞NF-κB通路相关蛋白表达的影响 为探究香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞NF-κB通路的影响，蛋白印迹检测NF-κB P65和p-NF-κB P65蛋白水平。如图6所示，IL-1β组p-P65/P65明显高于对照组(P<0.05)。Diosm+IL-1β组p-P65/P65明显低于IL-1β组(P<0.05)。上述结果说明，香叶木素可降低IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞P65磷酸化水平的升高。

图7免疫荧光染色观察NF-κBP65细胞定位

Fig.7CellularlocalizationofNF-κBP65wasobservedbyimmunofluorescencestaining

Note: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs IL-1β group.

2.6香叶木素会抑制IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞NF-κB P65从细胞质向细胞核的转运 通过免疫荧光染色观察香叶木素对IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞NF-κB P65细胞定位的影响。由图7可知，IL-1β组P65大部分分布在细胞核中，平均每个细胞核内P65+数量明显多于对照组(P<0.05)。Diosm+IL-1β组细胞核中P65的分布相对变少，平均每个细胞核内P65+数量明显少于IL-1β组(P<0.05)。由此可见，香叶木素会降低IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞NF-κB P65从细胞质向细胞核的转运，抑制NF-κB通路的活化。

3 讨论

目前对骨关节炎的传统治疗手段主要包括物理治疗和止痛药，不同程度的骨关节炎需选择不同的方法[6]。对轻度骨关节炎患者，用对乙酰氨基酚可减轻疼痛感，但它不能降低炎症，且长期服用会导致肝损伤；对中度骨关节炎患者，用非甾体类抗炎药可以止痛也可减轻炎症，但长期服用会引起消化不良，心血管问题、胃出血及肾脏和肝脏损伤等。对重度骨关节炎患者需使用阿片类药物和麻醉剂，但服用阿片类药物和麻醉剂会产生依赖性并造成恶心、便秘、嗜睡等不良反应[7,8]。越来越多的研究表明许多来源于植物的天然化合物有助于各类疾病的治疗。细胞凋亡异常是各类疾病的特质之一。大量文献报道多种植物提取物具有抑制细胞凋亡的功能。有研究表明生姜具有减弱IL-1β诱导软骨细胞凋亡的作用[8]。Wang等[9]发现水晶兰苷可减弱IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡。据文献报道姜黄素可以抑制骨关节炎软骨细胞凋亡[10]。有研究发现黄连素可抑制硝普酸钠诱导的软骨细胞凋亡[11]。有数据显示香叶木素可减轻缺血再灌注导致的小鼠肾脏细胞凋亡[12]。据报道香叶木素可降低阿霉素诱导的人类视网膜色素上皮细胞凋亡的增加[13]。本文结果显示，香叶木素会抑制IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡的增加。

细胞外基质的主要成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖及细胞外基质降解酶MMPs在骨关节炎中具有重要作用，在骨关节炎中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖通常会降低，MMPs会增加[14]。许多植物提取物可调节细胞外基质相关蛋白的表达。有数据显示杜仲水提取物可减弱骨关节炎大鼠滑膜液中MMP-13水平的升高[15]。据报道在IL-1β处理的软骨细胞中，异泽兰黄素可降低MMP-13水平[16]。Zhao等[17]发现在IL-1β处理的软骨细胞中，黄连素可提高Ⅱ型胶原蛋白水平。有研究表明羊栖菜提取物可抑制H2O2诱导的人软骨细胞Ⅰ和Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降低以及MMP-3和 MMP-7表达的升高[18]。有数据显示香叶木素可降低肝癌细胞MMP-2和MMP-9的表达[19]。据报道香叶木素可抑制卵清蛋白诱导的慢性哮喘小鼠呼吸道MMP-9表达水平的升高[20]。本研究结果显示，香叶木素可减弱IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞 Ⅱ 型胶原和蛋白聚糖蛋白水平的降低以及MMP-13 蛋白水平的升高。

越来越多的研究表明许多植物提取物具有很好的抗炎效果。有数据显示胡椒碱可降低IL-1β诱导的人骨关节炎软骨细胞NO和PGE2水平的升高[21]。有研究发现银杏叶提取物可降低IL-1诱导的人骨关节炎软骨细胞NO的释放[22]。有研究显示石榴提取物可降低IL-1β诱导的兔关节软骨细胞IL-6和PGE2水平的升高[23]。据文献报道银杏叶提取物EGb761可减弱LPS诱导的人软骨细胞NO、PGE2和IL-6水平的升高[24]。有研究发现含香叶木素的裂叶荆芥提取物可减弱卡拉胶诱导的足肿胀小鼠NO和TNF-α水平的升高[25]。据报道香叶木素可降低晚期糖基化终末产物诱导的神经细胞NO和TNF-α的释放[26]。Liu等[27]发现香叶木素可抑制LPS诱导的急性肺损伤中TNF-α和IL-6水平的升高。本文结果表明，香叶木素会抑制IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞NO、PGE2和TNF-α的上升。

NF-κB通路在各种细胞进程中起着重要作用，大量文献报道植物提取物可影响NF-κB通路。有研究发现桑叶提取物抑制IL-1β诱导的人软骨细胞NF-κB P65由细胞质向细胞核的转运[28]。Wang等[29]发现银杏叶提取物EGb761可降低TNF-α诱导的人软骨细胞p-NF-κB P65蛋白水平，抑制NF-κB 通路的活化。据报道南山藤提取物可抑制IL-1β诱导的人软骨细胞NF-κB P65磷酸化水平的升高[30]。有研究显示香叶木素可减弱蛙皮素诱导的急性胰腺炎中NF-κB P65由细胞质向细胞核的转运[31]。据文献报道五味子提取物可降低IL-1β诱导的人软骨细胞NF-κB P65由细胞质向细胞核的转运[32]。有研究表明香叶木素可抑制急性肝衰竭小鼠肝细胞中NF-κB P65从细胞质向细胞核的转运[33]。本文结果显示，香叶木素可降低IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞P65磷酸化水平的升高，减弱NF-κB P65从细胞质向细胞核的转运，抑制NF-κB通路的活化。

本研究表明，在IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞中，香叶木素可改善细胞变形及细胞数目的下降，减轻细胞凋亡的增加，抑制Ⅱ型胶原和蛋白聚糖蛋白水平下降和MMP-13蛋白水平升高，降低NO、PGE2和TNF-α水平的上升，减弱NF-κB P65磷酸化水平的升高，抑制NF-κB P65从细胞质向细胞核的转运。综上所述，香叶木素可通过抑制NF-κB通路活化缓解IL-1β诱导的新生大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡和免疫反应。下一步在动物模型上研究香叶木素对骨关节炎的影响，为开发新的有效的骨关节炎治疗手段提供理论依据。