彭朝阳 贾廷印 李好朝 乔泽强

(南阳医学高等专科学校第一附属医院普通外科,南阳473058)

肝癌是全球第六大常见癌症，占全球癌症患者的5.6%，而且肝癌致死率高，肝癌致死人数占全球27种常见癌症致死总数的9.1%，居第二位[1]。中国历来就是肝癌高危地区，约一半的肝癌新增病例和死亡病例都发生在中国[2,3]。2015年中国新增肝癌病例46.6万，肝癌死亡病例42.2万[4]。肝癌给中国造成了严重的社会经济负担。开发有效的肝癌治疗方法对中国卫生医疗系统具有重要意义。大量研究表明在肝癌的治疗中传统中药的辅助性治疗有助于提高肝癌患者存活[5]。北五味子作为传统中药已具有几千年的历史，常被用于治疗胃肠道疾病，呼吸衰竭，心血管疾病及过度出汗和失眠等。五味子乙素(化学结构式见图1 )是北五味子最主要的活性物质，属于联苯环辛烯类木脂素，可诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞转移，有利于胆囊癌及神经胶质瘤等癌症的治疗[6,7]。但五味子乙素在肝癌中的研究还比较缺乏，有待进一步研究。本研究主要目的是探索五味子乙素对高转移能力的肝癌细胞HCCLM3存活和运动能力及血管新生因子的调节作用。

图1 五味子乙素化学结构式

1 材料与方法

1.1材料 高转移能力的肝癌细胞系HCCLM3来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。五味子乙素购自Sigma公司。培养基 DMEM和胎牛血清购自赛默飞世尔科技公司。MTT购自上海生工。细胞凋亡检测试剂盒Annexin V Apoptosis Detection Kit和Transwell小室及人工基底膜购自美国BD公司。抗Bcl 2相关蛋白X(Bcl-2-associated X protein,Bax)抗体、抗B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma 2,Bcl-2)抗体、抗基质金属蛋白酶2(Matrix metalloprotein2,MMP-2)抗体、抗MMP-9抗体、抗血管内皮细胞生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)抗体、抗表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)抗体和抗成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药物处理 HCCLM3细胞于含10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基，并置于37℃，5% CO2的恒温培养箱中培养。当细胞增殖到约80%时进行传代。不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L) 五味子乙素处理HCCLM3后利用MTT检测细胞存活率。后续实验选择5、10、20 μmol/L的五味子乙素进行处理，对照组用DMSO代替五味子乙素。

1.2.2MTT检测细胞存活力 HCCLM3细胞制成1×104个/ml的细胞悬液接种到96孔板中，过夜培养后弃去培养液，加入含不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L)五味子乙素的培养液培养48 h。向孔板中加入MTT溶液孵育4 h后弃上清，加入DMSO振荡10 min，溶解结晶物后570 nm处检测吸光值。

1.2.3流式细胞术检测细胞凋亡 五味子乙素处理48 h后，将各组待测细胞用1×的Binding buffer制成1×106个/ml的细胞悬液。接着用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)对细胞进行染色15 min，然后利用流式细胞仪对染色的细胞进行检测。

1.2.4蛋白印迹 五味子乙素处理48 h后用PBS清洗待测细胞3次后，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，100℃变性5 min后等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜。5%的BSA封闭1 h后加入相应的一抗，4℃过夜孵育，第二天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.2.5Transwell检测细胞侵袭 用含1%胎牛血清的DMEM培养液将各组细胞制成1×106个/ml的细胞悬液，加入铺有人工基底膜的Transwell的上室中，下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培养液。37℃培养24 h后，用0.5%的结晶紫对上室底部细胞进行染色，用棉签除去上室内侧的细胞。显微镜下观察并统计细胞数量。

1.3统计学分析 实验数据用SPSS16.0软件进行统计学分析，两两比较用独立的t检验，P<0.05认为差异存在明显统计学意义。

2 结果

2.1五味子乙素对肝癌细胞HCCLM3存活力的影响 不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、2、5、10、20、40、80、200、400 μmol/L)五味子乙素处理HCCLM3后利用MTT检测细胞存活率，分析五味子乙素对肝癌细胞存活力的影响。图2 显示，当五味子乙素小于20 μmol/L时，HCCLM3细胞存活率没有显著变化，维持在80%以上。当五味子乙素大于20 μmol/L时HCCLM3细胞存活率急剧下降，降低到80%以下。上述结果表明，小于20 μmol/L的五味子乙素对HCCLM3细胞存活力无明显影响，大于20 μmol/L的五味子乙素会降低HCCLM3细胞存活力。

2.2五味子乙素促进HCCLM3细胞凋亡 流式细胞术检测五味子乙素(5、10、20 μmol/L)处理后HCCLM3细胞凋亡率，分析五味子乙素对肝癌细胞凋亡的影响。由图3可知，5 μmol/L五味子乙素组细胞凋亡率与DMSO组无明显变化，10和20 μmol/L五味子乙素组细胞凋亡率明显高于DMSO组(P<0.05)。由此可见，五味子乙素具有诱导HCCLM3细胞凋亡的作用。

2.3五味子乙素对细胞凋亡标记蛋白表达的影响 通过蛋白印迹检测五味子乙素对HCCLM3细胞凋亡标记蛋白表达的影响。如图4所示，5 μmol/L五味子乙素组Bcl-2蛋白相对表达量明显低于DMSO组(P<0.05)。与DMSO组相比，10和20 μmol/L五味子乙素组Bax蛋白相对表达量明显升高，Bcl-2蛋白相对表达量明显下降(P<0.05)。以上结果说明，五味子乙素会增强HCCLM3细胞Bax表达，抑制Bcl-2表达。

2.4五味子乙素降低HCCLM3细胞侵袭 利用Transwell检测五味子乙素(5、10、20 μmol/L)处理后HCCLM3细胞侵袭，探究五味子乙素对肝癌细胞侵袭的影响。由图5可知，五味子乙素(5、10、20 μmol/L)组每个视野下侵袭细胞数目明显少于DMSO组(P<0.05)。上述结果表明，五味子乙素可减弱HCCLM3细胞侵袭。

图2 MTT检测细胞活力

图3 流式细胞术检测细胞凋亡

2.5五味子乙素抑制细胞侵袭标记蛋白表达 蛋白印迹检测HCCLM3细胞MMP-2和MMP-9表达，分析五味子乙素对侵袭标记蛋白表达的影响。如图6所示，五味子乙素(5、10、20 μmol/L)组MMP-2和MMP-9相对蛋白表达量明显低于DMSO组(P<0.05)。以上结果说明，五味子乙素会降低HCCLM3细胞侵袭标记蛋白MMP-2和MMP-9表达。

2.6五味子乙素减弱血管新生因子表达 为分析五味子乙素对HCCLM3细胞血管新生因子表达的影响，蛋白印迹检测VEGF-A,EGF和bFGF表达。图7显示，5 μmol/L五味子乙素组EGF和bFGF蛋白相对表达量明显低于DMSO组(P<0.05)。与DMSO组相比，10和20 μmol/L五味子乙素组VEGF-A、EGF和bFGF蛋白相对表达量明显下降(P<0.05)。由此可见，五味子乙素可抑制HCCLM3细胞血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表达。

图4 蛋白印迹检测细胞凋亡标记蛋白表达

图5 Transwell检测细胞侵袭

图6 蛋白印迹检测细胞侵袭标记蛋白表达

图7 蛋白印迹检测血管新生因子表达

3 讨论

研究表明对不同阶段的肝癌需选择不同的治疗方法，早期肝癌一般可以通过外科手术(部分肝切除或肝移植)进行治疗，但肝癌一旦转移外科手术就不再适用，目前对中期和晚期的肝癌主要依靠化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗及溶瘤病毒治疗等[8]。但这些方法存在着副作用大及效果不理想等缺点。越来越多的研究表明许多天然植物产物在癌症治疗方面发挥着积极作用[9,10]。

大量文献报道多种植物提取物具有抑制癌细胞活力及促进癌细胞凋亡的功效。有研究表明地耳草提取物可增强肝癌HepG2细胞Bax表达，减弱Bcl-2表达，促进细胞凋亡[11]。Lin等[12]发现来源于线状花瞿麦的异红草素可抑制肝癌HepG2细胞活力，提高Bax表达，降低Bcl-2表达，诱导细胞凋亡。有数据显示来源于橘核的橘皮苷可增强肝癌HepG2细胞Bax表达，提高细胞凋亡[13]。据报道五味子乙素可减弱胆囊癌细胞活力，促进细胞凋亡，抑制Bcl-2表达，提高Bax表达[7]。有研究发现在胆管细胞型肝癌中五味子乙素可降低细胞活力，诱导细胞凋亡，减弱Bcl-2表达，增强Bax表达[14]。另外，五味子乙素还可减弱结肠直肠癌细胞活力，促进细胞凋亡[15]。本研究结果显示，小于20 μmol/L的五味子乙素对HCCLM3细胞存活力无明显影响，大于20 μmol/L的五味子乙素会降低HCCLM3细胞存活力。五味子乙素(10、20 μmol/L)会增强Bax表达，抑制Bcl-2表达，诱导细胞凋亡。

癌细胞侵袭能力在癌症转移过程中具有重要作用。许多植物提取物可抑制癌细胞侵袭。有数据显示雪莲提取物和来源于菩提树的三萜类化合物都可以减弱肝癌细胞MMP-2和MMP-9表达，降低胞侵袭能力[16,17]。另外，蚁巢木叶子提取物会降低肝癌SK-Hep1和 Huh7细胞MMP-2和MMP-9活性，减弱细胞侵袭能力[18]。有研究表明猕猴桃根提取物具有降低肝癌HepG2和MHCC97H细胞MMP-2和MMP-9表达，抑制细胞侵袭的功效[19]。据报道在神经胶质瘤细胞中，五味子乙素可降低MMP-9表达，抑制细胞侵袭[6]。有研究发现五味子乙素还可抑制肺腺癌细胞MMP-2和MMP-9表达，减弱细胞侵袭能力[20]。本文结果表明，五味子乙素会降低HCCLM3细胞MMP-2和MMP-9表达，减弱细胞侵袭能力。

越来越多的研究表明多种天然植物产物具有抑制血管新生的功能[21]。有数据显示黄花败酱提取物可降低结肠直肠癌细胞VEGF-A表达[22]。Atmaca等[23]发现三裂鼠尾草提取物可减弱前列腺癌细胞EGF和bFGF表达。有研究表明黄连提取物可抑制肝癌MHCC97L和HepG2细胞VEGF表达[24]。据报道苦味叶下珠及珍珠草提取物具有降低黑色素瘤细胞HIF-α和VEFG表达的功效[25]。本研究结果显示，五味子乙素可抑制HCCLM3细胞血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表达。

总体来说，在高转移能力的肝癌HCCLM3细胞中，五味子乙素可通过Bax/Bcl-2介导的信号通路诱导细胞凋亡；并通过降低MMP-2和MMP-9表达减弱细胞侵袭；同时还可抑制血管新生因子VEGF-A、EGF和bFGF表达。综上诉述，五味子乙素可诱导肝癌细胞HCCLM3凋亡，降低细胞侵袭能力及血管新生因子表达。后续将进行体内研究，分析五味子乙素对肝癌肿瘤进程的影响，为挖掘新的肝癌治疗方法提供理论依据。