夏 莉 齐 红 狄 娜 魏天雪 迟艳飞 牟正华 魏本杰 刘玉侠④

(吉林省人民医院，长春130021)

胃癌是世界第二大癌症死亡原因[1]。我国胃癌的发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的第2位[2]。目前胃癌的治疗以传统手术和化疗为主，尽管胃癌综合治疗的疗效得以提高，但传统方法治疗胃癌已处于发展瓶颈期，而胃癌的遗传复杂性和异质性也很大程度上影响了经典靶向治疗的有效性[3，4]。所以开发新疗法成为亟待解决的问题。γ9δ2 T淋巴细胞(γ9δ2 T细胞)是近年来日益受到重视的T细胞亚群，具有很强的细胞毒功能，在机体抗肿瘤免疫中具有重要作用。本研究采用焦磷酸溴代醇(Bromohydrin pyrophosphate,BrHPP)联合白细胞介素2(IL-2)诱导γ9δ2 T细胞产生的方法，探讨γ9δ2 T细胞对胃癌的治疗作用。建立新的肿瘤生物治疗方法，为胃癌的治疗提供一种有效的免疫治疗方法和手段。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器 生物倒置显微镜(Olympus，Japan)；低温低速离心机(SORVALL RTT，USA),全自动酶标仪(Labsystems Dragon),超净工作台(苏州净化设备厂),流式细胞仪(BD公司)。

1.1.2试剂 RPMI1640培养基：Gibco公司； BrHPP：法国Inserm研究所的Mary Poupot博士馈赠；IL-2：北京四环生物制药有限公司；高效离心管、淋巴细胞分离液：天津灏洋生物技术有限公司； MTT(噻唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜)：Sigma公司；胎牛血清：天津康源生物技术有限公司；anti-human TCRγ/δ、Human TNF-α ELISA Kit、Human IL-2 ELISA Kit、Human IFN-γ ELISA Kit、FITC anti-human CD3：Biolegend公司；FITC Mouse Anti-human Vγ9TCR、PE Mouse Anti-human Vδ2 TCR：BD公司。

1.1.3瘤株 胃癌细胞株SGC-7901由吉林省肿瘤防治研究所提供。

1.2方法

1.2.1γ9δ2T细胞的制备及鉴定 取健康志愿者外周血40 ml，用TBD高效离心管分离单核细胞(PBMC)并计数，调细胞数为1×107ml-1,放入25 ml培养瓶内进行培养，共3瓶，每瓶10 ml。培养液为含有10%胎牛血清的RPMI1640，培养2 h后，向培养瓶内加入以下物质：第1瓶加入IL-2 1 000 U/ml；第2瓶加入BrHPP 3 μmol/L、IL-2 1 000 U/ml；第3瓶加入anti-human TCRγ/δ 0.4 μg/ml、IL-2 1 000 U/ml 进行体外诱导扩增，每3 d半量换液，并补加IL-2，将两种方法培养10 d的细胞分别用FITC-γ9TCR、PE-δ2TCR及FITC-γ9PE-δ2TCR标记后，用流式细胞仪进行检测。

1.2.2培养细胞的上清细胞因子检测 我们对两种方法培养10 d的细胞培养上清进行了TNF-α、IL-2、IFN-γ等细胞因子的检测，同时设未加任何成分的培养上清作为阴性对照。方法简述如下：按照试剂盒说明，将TNF-α、IL-2、IFN-γ等的标准品倍比稀释成6个浓度，然后将稀释好的标准品和样品(留取的培养上清)以及阴性对照加入到已包被好抗体并经过洗涤的微孔板内，标准品和样品各做3复孔，按照步骤操作，最后在酶标仪450 nm处测OD值，根据OD值做出标准曲线，根据标准曲线计算样品浓度。

1.2.3培养细胞对胃癌细胞株SGC-7901的杀伤活性实验

1.2.3.1培养胃癌细胞株SGC-7901 从液氮中取出SGC-7901细胞，37℃快速复温，用生理盐水洗涤后，加入到含10%胎牛血清IMDM培养基的25 ml培养瓶进行培养。待长到指数生长期，细胞活性大于95%，用胰酶消化后离心，计数，使细胞浓度为5×104ml-1，加到96孔细胞培养板，0.1 ml/孔，待用。

1.2.3.2两种方法培养细胞对SGC-7901的杀伤活性 将培养10 d并鉴定的γ9δ2T细胞计数为2.5×106ml-1，按以下设计加入到已经接种SGC-7901的96孔细胞培养板。第1组： anti-human TCRγ/δ+IL-2;第2组： anti-human TCRγ/δ+IL-2+SGC-7901;第3组：BrHPP+IL-2;第4组：BrHPP+IL-2+SGC-7901;第5组：SGC-7901。每组设6复孔，放入37℃，5%CO2培养箱培养24 h，培养结束前4 h，每孔加20 μl MTT，培养结束后，小心吸去上清，每孔加DMSO 150 μl，振荡混匀后，用酶标仪在492 nm处测定OD值。根据以下公式计算杀伤活性。杀伤活性=(1-实验组OD值-效应细胞OD值/靶细胞OD值)×100%。

2 结果

2.1anti-human TCRγ/δ联合IL-2诱导细胞γ9TCR、δ2TCR及γ9δ2TCR的表达 从图1可以看出，anti-human TCRγ/δ联合IL-2培养的细胞γ9TCR表达较高，为98.10%，δ2TCR表达较低，为10.60%，而γ9δ2TCR共同表达较低，为10.70%。

2.2BrHPP联合IL-2培养细胞的γ9TCR、 δ2TCR及γ9δ2TCR表达 从图2可以看出，BrHPP联合IL-2培养的细胞γ9TCR和δ2TCR表达都较高，分别为65.10%和64.10%，γ9δ2TCR共同表达也较高，为61.60%。

图1 Anti-human TCRγ/δ联合IL-2诱导细胞γ9TCR、δ2TCR及γ9δ2TCR的表达

图2 BrHPP联合IL-2培养细胞γ9TCR、δ2TCR及γ9δ2TCR表达

GroupsContent(pg/ml)IL-2TNF-αIFN-γControl group100.67±0.00762.91±0.00658.73±0.005anti-human TCRγ/δ3 157.44±0.0981)170.53±0.0111)1 749.98±0.0661)BrHPP3 237.54±0.1621)2)158.91±0.0051)2)1 851.40±0.0951)2)

Note：1)P<0.01，compared with control group；2)P>0.05，compared with anti-human TCRγ/δ group.

表2两种方法诱导细胞对SGC-7901体外杀伤活性

Tab.2KillingactivityoftwomethodsinducedcellstoSGC-7901

GroupsOD(x±s,n=6)Killing activity(%)anti-human TCRγ/δ+IL-21.073±0.21878.80anti-human TCRγ/δ+IL-2+SGC-79011.227±0.055BrHPP+IL-21.237±0.09277.06BrHPP+IL-2+SGC-79011.404±0.055SGC-79011.476±0.116

2.3两种方法培养细胞上清的细胞因子检测结果 从表1可以看出，两种方法诱导的细胞培养上清IL-2、TNF-α、IFN-γ的细胞因子表达与对照组比较有明显差异(P<0.01)；但两实验组之间比较没有差异(P>0.05)。

2.4两种方法诱导细胞对SGC-7901体外杀伤活性实验结果 从表2可以看出，两种方法诱导的细胞对SGC-7901的杀伤活性没有明显差别。

3 讨论

依据GLOBOCAN-2012数据，胃癌在全球恶性肿瘤中，发病率位居第6位， 死亡率位居第4位，超过70%的病例发生在亚洲[5]。中国胃癌的总体发病人数约占全世界的42%，并且有明显的地区和城乡差异，城市为15.3/10万，农村为24.4/10万，是城市的1.6倍[1]。因为早期胃癌无明显症状，所以60%以上的患者在就诊时已达进展期，5年生存率仅为2%～15%[5]。尽管部分早期胃癌可以通过综合治疗治愈，但是术后复发率高，且多数患者初诊时已是晚期。国内外研究显示抗HER2治疗联合化疗显著改善了晚期HER2阳性患者的预后。但是中国胃癌患者HER2阳性率为12%～13%，对于HER2阴性患者的预后改善仍刻不容缓。为了寻找新的胃癌治疗方法，本实验选用BrHPP联合IL-2诱导产生γ9δ2T细胞的方法，探讨γ9δ2T细胞对胃癌的治疗作用。

T细胞可根据表面抗原受体(TCR)的不同表达而分成两类T细胞：TCRαβT细胞和TCRγδT细胞。γδT细胞是近年来逐渐认识的一种T细胞亚群，根据其TCRγ、δ链的不同组合分为多个亚群。TCRγδ分子结构中的γ链、δ链和CD3分子共同构成γδT 细胞的抗原识别受体。由于Vγ和Vδ配对的有限性和N区插入较少，使得TCRγδ的CDR3变化较小，这也决定了TCRγδ的生物学功能不同于TCRαβ。γδT 细胞是分布于机体的第一道屏障，通过直接识别入侵生物表面的抗原，发挥其毒性T细胞作用[8]。γδT 细胞通过穿孔素-颗粒酶途径、抗体依赖性细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等方式裂解肿瘤细胞发挥直接抗肿瘤作用[9,10]。

γδT细胞的诱导方法主要有磷酸抗原如唑来膦酸、HMBPP(4-羟基-3甲基2-烯基焦磷酸)及抗TCRγ/δ单抗(anti-human TCRγ/δ)等[11-13]。

BrHPP是一种新的人工合成的磷酸抗原，能与IL-2一起特异性地诱导单核细胞向γ9δ2T细胞分化。为了探讨其对γ9δ2T细胞的诱导分化作用，本研究采用BrHPP联合IL-2的方法诱导γ9δ2T细胞的生成，并与anti-human TCRγ/δ联合IL-2的方法作为比较，从培养10 d的检测结果看，BrHPP联合IL-2培养诱导的细胞γ9δ2TCR有较高的表达，为61.60%，其中γ9TCR为65.10%，δ2TCR为64.10%；anti-human TCRγ/δ联合IL-2培养诱导的细胞γ9δ2TCR表达率较低，为10.70%，但是其中的γ9TCR表达较高，为98.10%，δ2TCR表达较低，为10.60%。我们同时对培养细胞上清进行了IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的检测，从检测结果看，两种方法诱导的细胞培养上清三种细胞因子表达均较高，与对照组比较有明显差异(P<0.01)，但两实验组之间比较没有差异(P>0.05)。在此基础上，我们用两种方法培养的细胞对胃癌细胞株SGC-7901的杀伤作用进行比较研究，结果证明两种方法诱导的γ9δ2T细胞对SGC-7901均具有较强的杀伤效果，分别达到77.06%和78.80%。

γ9δ2T细胞对肿瘤的作用主要是以非MHC分子限制性的方式直接识别和杀伤肿瘤细胞[14,15]γ9δ2T细胞是γδT细胞的亚群，它包含有γ9TCR和δ2TCR，它们在γδT细胞的功能中起重要作用，虽然本实验中anti-human TCRγ/δ+IL-2诱导的γ9δ2T细胞总体表达较低，但是其中的γ9TCR表达非常高，对γ9δ2T细胞的功能发挥起了非常重要的作用。另外γ9δ2T细胞还可以通过分泌细胞因子如IL-2、TNF-α、IFN-γ等发挥抗肿瘤功能[16,17]。TNF-α是一种小分子蛋白。它可以与肿瘤细胞质膜特异性受体结合，导致溶酶体破裂，释放出溶酶体酶而促使细胞自溶。已有研究证实TNF-α对多种肿瘤具有细胞毒和抑制生长作用[18]。IL-2是一种具有多重生物学功能的细胞生长因子，它可以促进T细胞生长、增殖及分化[19]，调节NK细胞并保持它的自然杀伤力[20]，诱导细胞毒性T细胞的增殖和产生，与其他细胞因子协同作用等[17]。目前IL-2已被广泛应用于肿瘤的治疗。IFN-γ是一种多功能细胞因子，除了具有抗病毒活性外，还能抑制肿瘤细胞增殖和参与调节免疫应答作用[21]，因而在肿瘤治疗中也起着重要作用。本实验通过检测培养细胞上清中的IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子的表达以及对SGC-7901的杀伤实验结果证明了γ9δ2T细胞对肿瘤细胞的作用。

目前，磷酸化合物作为诱导γδT细胞的诱导剂，已被广泛认同和应用。本实验为了寻找新的γ9δ2T细胞的诱导剂而选择了BrHPP，从实验结果看，BrHPP联合IL-2诱导的γ9δ2T细胞无论从表面标志、细胞因子表达还是对胃癌细胞的杀伤活性都取得了理想的效果。

本实验选择了anti-human TCRγ/δ联合IL-2作为比较研究，从结果看此方法也取得了较好的结果，而且在我们之前的研究中也证实了它的作用[22]。因为anti-human TCRγ/δ的费用较高，我们就想寻找一种能够与其起到同样效果，价格低廉的产品替代它，使γ9δ2T细胞的研究和应用能广泛开展。通过我们的努力，最终找到了这种经济实用而且有效的化合物，为γ9δ2T细胞的培养扩增和应用提供了经济可行的方法。此研究结果初步证明了用BrHPP联合IL-2诱导的γ9δ2T细胞的抗肿瘤功能，为胃癌的治疗提供一种有效的免疫治疗方法和手段。