李梦婷

摘 要：本实验以秋眠级不同的两种紫花苜蓿德钦（代号10号）和阿尔冈金（代号11号）为材料，旨在探讨紫花苜蓿这个两个品种在高温胁迫下的适应情况，并比较其变化程度，为选择耐热性强的紫花苜蓿品种提供理论依据，提供一个很好地被植物参考。通过对两种不同秋眠级紫花苜蓿叶片在不同温度下过氧化物酶（POD）活性和同工酶的测定，结果表明：过氧化物酶（POD）两种生理指标的综合评价下可以分析比较出11号品种比10号品种紫花苜蓿的耐热性强。实验结论：在同等高温胁迫条件下：11号耐热性强于10号，11号可作为我国南方的推广和应用的参考材料依据。

关键词：高温；紫花苜蓿；耐热性；过氧化物酶

1 前言

紫花苜蓿Medicago sativa是世界广泛栽培的优质豆科牧草之一， 属多年生草本植物，是我国草食畜禽和奶牛饲养业的主要饲草， 也是工业饲料的主要原料和改良农业生态环境的优良草种， 在我国牧草产业化和栽培草地建设中占有主要地位[1]，而耐热性差限制了它在我国南方的推广和应用，由于紫花苜蓿在日平均气温15-21℃ 时生长最好，常温下生长适宜温度为20-25℃，紫花苜蓿能够在白天平均30-35℃的高温下生长 ，但在生长过程对高温却极为敏感，并且在高温逆境胁迫下，生长着的植物体内会发生一些异常的生理生化反应：首先是代谢速率逆转、无氧条件下蛋白质降解、生物膜系统结构和功能破坏，最终导致植物死亡[2]。目前人们对苜蓿抗性的研究多集中在抗旱、抗寒、耐盐碱等方面，对苜蓿热胁迫反应及抗热性鉴定研究较少[3]，因此对于紫花苜蓿这种高蛋白质植物来说， 在南方的种植其耐热性的筛选研究是很重要的。

POD过氧化物酶广泛存在于植物体中， 是活性较高的一种酶，是酶促活性氧清除系统的主要组成成分，能催化H2O2转化为H2O，并能分解植物体内某些代谢物需氧脱氢后所产生的有害物质，防止或减轻因有害物质的积累而对植物造成的伤害，因此其活性的高低可以反应植物的代谢状况和对环境的适应性[4]。因此本实验采用POD活性的测定及同工酶分析的方法可以定性定量的作为比较两种紫花苜蓿的评价指标。本研究以秋眠级不同的阿尔刚金2级文中代号为11号和德钦3级（由毕玉芬教授提供）文中代号为10号。紫花苜蓿为材料，研究比较高温对这两种秋眠级有差异的紫花苜蓿叶片中的过氧化物酶（POD）活性和同工酶的影响程度，旨在探讨不同品种的紫花苜蓿对高温的适应性，进而能为南方耐热性强的紫花苜蓿品种选择提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 实验时间、地点

本研究实验于2011年7月8日播种，种植于云南农业大学园林园艺学院教学实验温室中，室内实验于2012年11月至2013年3月在云南农业大学动物科学技术学院草业科学实验室进行。

2.2 实验材料及仪器

2.2.1 供试材料：阿尔刚金（由百绿集团提供）文中代号为11号和德钦（由毕玉芬教授提供）文中代号为10号。

2.2.2 仪器 ：（1）分光光度计；（2）移液管及容量瓶（3）离心机（12 000r/min）；（4）研钵（5）垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；（6）稳流稳压电泳仪；（7）高速冷冻离心机；（8）电子天平；（9）电冰箱；（10）瓷盘、微量进样器；（11）电热恒温水浴锅；（12）电炉及试管等；（13）冰袋及量筒（14）离心试管

2.3 实验方法

2.3.1 实验材料培育

紫花苜蓿种子经0.2%高锰酸钾消毒20min后，用蒸馏水洗涤3次，分别种植在育苗盘中（红壤：泥炭土：细沙：珍珠岩=2：1：1：1）的方式种植于聚乙烯花盆（d=20cm，高25cm，花盆底部有7个出水孔），置于云南农业大学教学温室，生长条件是自然温度、每穴精选3粒大小均匀无破损的种子，置于PQX型多段可编程人工气候培养箱中，温度为25℃/20℃（白天/黑夜），光周期为14/10 （白天/黑夜）。每48小时浇水一次，以保持土壤湿润。5个月后移栽到直径为12cm的花盆内（栽培基质也为土培，红壤：泥炭土：珍珠岩：蛭石=1：2：1：1），每个盆内种3株。缓苗7天后，置于不同温度的PQX-1000B型多段可编程人工气候箱内进行。

2.3.2 实验设计

将预先培育好的18盆紫花苜蓿材料（每个品种重复6次）生长温度设置为常温25℃/20℃（昼夜，热激处理0d，作为对照），然后设置高温35℃/30℃（昼夜），光周期均为14/10 （昼夜），相对湿度控制在65%，光照强度设置为为400 μmol m-2 s-1。高温胁迫持续的时间设为28天，每7天取一次样，共取五个阶段的样品：即0 d （温度为25℃/20℃作为参照）， 7， 14， 21，28和35 d（温度为35℃/30℃高温），接着取出预先准备好的新鲜材料中已完全张开并且部位相同的叶片作为取样的叶片，主要用于测定蛋白质含量和干重。

2.3.3 过氧化物酶POD的提取及活性的测定[7]

POD活性以愈创木酚显色法测定，材料加入反应体系后直接进行测定，在分光光度计上以每分钟内A470nm变化为一个酶活性单位。

試剂：50mM Tris-HCL（PH=7.0），内含0.1mM EDTA、愈创木酚、酶液、5mM H2O2

POD的提取 ：准确称取紫花苜蓿10号、11号两个品种的叶片各0.25g。加适量液氮充分研磨（冰浴），分别加入2ml缓冲液（50mM Tris-HCL，pH7.0），12000r/min，40℃离心20min，取上清液，并量出上清液的体积，用于酶活性的测定。

2.3.4 过氧化物酶POD同工酶的测定方法[8]

POD同工酶技术能准确地表达种间或品种间的亲缘关系，已成为植物分类和鉴定研究重要方法，2O世纪7O年代以来，在草业科学领域中广泛应用于物种、变种和品种的区分鉴定 ，以及苜蓿材料亲缘关系、抗逆性、品种鉴定和分类方面[8]。

制备胶前：第一步：配制工作液

A液：丙烯酰胺储存液，100ml30%（W/V）丙烯酰胺，0.8%双丙烯酰胺。

方法：30g丙烯酰胺+0.8%双丙烯酰胺+ddH2O（超纯水）定容为100ml。

B液：4X分离胶缓冲液；100ml。

方法：1.5M Tris-HCL（Ph8.8）37.5+12.5水 18.2gTris溶于40ml ddH2O中，加入 HCl3.05ml+ddh2O定容为100ml。

C液：4X堆积胶缓冲液，100ml ；0.5M Tris-HCL（PH6.8）25+25ddH2O

方法：6.0gTris溶于40mlddH2O中，加入HCl4.16ml+ddH2O定容为100ml。

第二步：10%过硫酸铵，5ml

方法：0.5g过硫酸铵+5mlddH2O

第三步：电泳缓冲液，1L

方法：3gTris碱+14.4g甘氨酸+ddH2O定容1000ml（PH8.8）

第四步：5X样品缓冲液，10ml

方法：3.1ml 1LTris-HCL（PH6.8）

5.0ml 50%（V/V）甘油

1.0ml 1%溴酚蓝

1.4ml ddH2O

用微量移液器吸取样品酶粗液和制备凝胶

10%分离胶：加样顺序为A液3.3ml，B液2.5ml，ddH2O4.2ml，10%过硫酸铵50ul， TEMED5ul，10ml混合均匀，即为10%分离胶溶液。将按上数比例配成的分离胶液倒进已封口的玻璃夹板中。为了防止气泡产生，用移液枪将配好的分离胶缓慢注入电泳板内，当溶液距离短板1.5cm时停止，用注射器装水在胶液上表液较注1层（1-5mm）水，用于隔绝空气，使胶面平整。聚合的最适温度为25C。当聚合完成时可看到水与凝固的胶棉面有明显的水胶分界线，用滤纸吸出水层，在用少量浓缩胶缓冲液淋洗分离胶的上腔。等待时间为30-60min。

5%浓缩胶：加样顺序A液0.67ml，C液1.0ml，ddH2O2.3ml，10%过硫酸铵30ulTEMED5ul，4ml混合均匀，即为5%分离胶溶液。倒去聚合分离胶表面的水层，将按上述顺序配置好的浓缩胶倒进玻璃夹板中分离胶的上面，如胶高度为距离玻璃板上缘约0.5处，轻轻插入梳子。

加样

上样缓冲液按4：1比列混合即20ul+5ul加入每一梳齿。不同样品之间要防止污染，每空进样量为18ul。

电泳

电压200v（保持恒压，0.75mm的胶，电流开始时为100mA，在电泳结束时为60mA），待溴酚蓝移至距玻璃板下端1-5mm处停止电泳。电泳时间为30-40min。

电泳结束后，小心地揭开玻璃板，用注射器冲洗胶的四周，用小刀轻敲玻璃板的边缘，使凝胶剥离开玻璃板，滑入事先准备好的装有染液的磁盘中染色。

染色

3%的H202；取10ml的30%H2O2，用ddH2O定容至100ul。联苯胺醋酸溶液：0.25联苯胺溶于2.25ml文火加熱的冰醋酸，加入10.25ml的ddH2O。将12.5ml联苯胺醋酸溶液，5ml3%H2O2混合均匀后用ddH2O定容至250ml，即配成POD染液。将剥离的胶片浸入染色液中5-10min，取出用ddH2O漂洗，停止染色。

2.4 处理软件

3 次重复所得数据用Excel进行分析。

3 结果与分析

3.1 高温胁迫处理下2种紫花苜蓿（POD）活性的分析比较

由实验结果可知，随着高温胁迫时间的延长，两个紫花苜蓿品种的POD活性呈现先降低后升高再降低的变化趋势。在0天时由于在常温（25℃/20℃）两个紫花苜蓿品种的活性达到最大值，11号活性在1600-1800（μg/g.DW.min）之间，10号活性在1400-1600（μg/g.DW.min）之间，它们的活性差值接近200（μg/g.DW.min）；在高温胁迫（温度为35℃/30℃）的第7天这个时间段时（转折期），11号和10号活性相对于0天时都开始下降，且11号和10号将接近重合，活性大约在1000（μg/g.DW.min）处，这个间段的10号和11号的活性差距不明显；随后在胁迫的7-4天之间，11号相对于10号还有活性有上升的趋势，且11号出现胁迫后活性的最大值出现在1000（μg/g.DW.min）处，而10号从转折点处就一直在下降，11号和10号的活性差值接近300（μg/g.DW.min）；从14-28天这个间段分析，两个品种的活性出现先下降后上升，但是11号的 POD活性下降的趋势一直低于10号，它们之间的活性差值也是接近300（μg/g.DW.min）；在第28-35天时，随胁迫时间的延长，两个品种都开始下降，11号处理组 POD活性下降程度略显高于10号组紫花苜蓿。图1可知受高温胁迫时11号的活性下降程度要小于10号，也就是说在受到高温胁迫时11号的抗性表现出比10号强的优势。

3.2 高温胁迫处理下2种紫花苜蓿（POD）同工酶的酶谱分析比较

在相同的条件下，对紫花苜蓿两种材料10号、11号的POD同工酶进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。经比较首先可以看出，两个品种在0天没受到胁迫时都可以清楚的数出两个品种的酶谱数，实验中能数出11号品种的酶条带数有9条，10号的有8条。其次从高温胁迫后11号的酶条带数比10号的酶条带数在颜色着色上有明显差别，11号品种的着色要深的多，并且11号的条带数要比较清晰，在受到胁迫后，也就是从第7天开始，11号品种酶带数和0天区别并不是很大，还能清楚的数出条带数，而10号品种则在第7天时，其酶条带数就和0天有差异，第3条酶条带的颜色开始变得比较模糊，颜色比较浅。再次还可以从条带的宽度上比较出，11号的条带要比10号的稍微宽一点，同时在横向上分析它们之间的同工酶谱带数、酶活性的强弱的差别之中，可以分辨得出它们都有相同的母带5条，但其中10号的第2条、第7条在受到高温胁迫后比11号品种同等酶条带模糊的多，为多态性条带，活性相应也比较弱。由正级到负级总体上观察图片比较可得11号品种出现拖带的条带数比10号的要多，因此活性相比10好要强，可见用同工酶分析可比较出11号耐热性要优于10号品种。

4 讨论

4.1 POD是植物体内重要的活性氧清除酶，可以有效地清除活性氧自由基，减少丙二醛的积累，对抵御膜脂过氧化和维护膜结构的完整性具有重要作用。因此本实验对提高紫花苜蓿的抗逆性有重要的意义。

4.2 广泛存在于植物体内的过氧化物酶同工酶是植物体适应环境变化并对变化了的环境做出灵敏反应的一类酶，常被认为是植物对逆境环境抗逆作用大小的标志[5]。因此对紫花苜蓿高温胁迫的耐热性生理研究受到了广泛的关注，所以本实验的研究也因此可以提供一些理论依据。

4.3 正常情况下植物体内的各项代谢及生理生化过程都是比较稳定而协调的，当植物受到逆境的胁迫时，植物体内的各种代谢活动发生变化，植物对逆境做出反映[6]。因此本实验的的研究也仅仅只是测定紫花苜蓿耐热性生理指标中的过氧化物酶一方面，对紫花苜蓿的耐热性的比较研究还需要更进一步加深。

5 结论

实验中，随着高温时间的延长，两种紫花苜蓿品种的活性都在下降，但11号品种下降的程度小于10号品种，差值在200-300（μg/g.DW.min）。用同工酶分析技术这种方法通过比较同工酶谱条带数、宽度和清晰程度可以分析出11號的条带数比10号多一条，酶条带的清晰程度强于10号，条带的宽度比10号稍宽。因此结合过氧化物酶（POD）两种生理指标的综合评价下可以分析比较出11号品种比10号品种紫花苜蓿的耐热性强。

参考文献

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[3]张晓霞，高永革，严学兵，等.紫花苜蓿抗热性鉴定与评价的研究进展[J].河南：草业科学.2010，27（2）：113-115.

[4]王小玲，高柱，余发新，等.外源水杨酸对观赏羽扇豆高温胁迫的生理响应[M].南昌：江西省科学院生物资源研究所.2011.

[5]邹春静，盛晓峰，韩文卿等.同工酶分析技术及其在植物研究中的应用[M].沈阳：生态学杂志.2009.63-69.

[6]绉琦.植物生理学实验指导[M].北京：中国农业出版社.2000.21-22.