杨靖 吴丽 周灵芝 赵志波 项孙敏 颜斌 吕运成 肖新华

南华大学附属第一医院1内分泌科，2儿科（湖南衡阳421001）；3南华大学医学院应用解剖与生殖医学研究所（湖南衡阳421001）

目前我国成人糖尿病在发病率为10.4%，其中2 型糖尿病占90%以上［1］。胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍是2 型糖尿病发病的两个核心环节。β 细胞合成与分泌胰岛素是受一系列转录激活因子和抑制因子共同调节的精密过程，其中转录抑制因子Sox6 在胰岛β 细胞的分化及维持其正常功能上具有重要的作用［2］。Sox6 通过抑制转录激活因子Pdx1 的表达而降低胰岛素的合成与葡萄糖刺激下的胰岛素分泌（glucose stimulated insulin secretion，GSIS）［3］。下调Sox6 的表达能促进胰岛素的合成与分泌，对糖尿病的防治具有重要意义。

MELKMAN-ZEHAVI 等［4］研究发现Dicer1 缺失小鼠胰岛β细胞Sox6 的表达可升高4 倍，说明Sox6的表达受到miRNAs 的调控。笔者通过生物信息学分析发现在胰岛细胞中高表达的miR-96 与Sox6 的3′非 编 码 区（3′-untranslated region，3′UTR）存在很好的靶向结合位点，但目前尚无二者相互作用的研究报道。为探索miR-96 可能通过靶向抑制Sox6 的表达而促进胰岛素的合成与分泌，在糖尿病的发生中起保护作用，本研究通过上调和下调MIN6 细胞miR-96 表达水平，探索miR-96对胰岛素合成和与分泌的影响及分子机制，为胰岛素分泌调控的认识提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与处理 MIN6 细胞与293T 细胞分别用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培养液培养，37 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中静置培养。细胞每2～3 天换液一次，细胞融合度达到80%～90%时进行传代。

1.2 miRNA 转染 细胞分为4 组：miR-96 mimics组，脂质体介导转染40 nmol/L miR-96 mimics；miR-96 inhibitor 组，脂质体介导转染80 nmol/L miR-96 inhibitor。miR-96 mimic 和inhibitor 对照组，脂质体介导转染miRNA control，浓度为40 nmol/L；

1.3 RNA 提取与荧光定量PCR Trizol 法提取总RNA。按照QIAGEN 公司miScriptII RT 试剂盒说明书行逆转录，ThermoFisher 公司SYBR Green PCR试剂盒行荧光定量PCR，PCR 引物序列见表1。反应条件为：95 ℃15min，95 ℃15s，60 ℃30 s，68 ℃30 s，共40 个循环。

表1 基因引物序列Tab.1 The primer sequences of the detected genes

1.4 GSIS 实验及ELISA 法检测胰岛素 MIN6细胞置于24 孔板中，待细胞贴壁融合度达到60%左右予不同处理，弃去原有培养基。加无糖Krebs-Ringer bicarbonate（KRB）溶液每孔500 μL，孵育1 h。弃无糖KRB 溶液，换用KRB 溶液配制的含3.3 mM 葡萄糖液孵育1 h 后收集上清液，换用16.7 mM 葡萄糖KRB 溶液，每孔500 μL，孵育1 h，收集上清液。所有收集的上清液都放置于-80 ℃，用ALPCO 公司Mouse High Range Insulin ELISA Kit检测胰岛素浓度，在450 nm 波长下酶标仪中读数。

1.5 双荧光素酶报告基因检测 参照Geneback收录的Sox6 序列，登录号为NM_021560.4，利用Primer Premier 5.0 软件对Sox 3′UTR 设计引物；以MIN6 细胞基因组DNA 为模板行PCR 扩增，构建野生型psi-CHECK TM-2-Sox6-WT 3′UTR 载体，同时对psi-CHECK TM-2-Sox6-3′UTR 载体上带有的miR-96 靶点序列中的seed sequence 进行UUUGGCA 到UUGAAUA 的点突变，构建突变型psi-CHECK TM-2-Sox6-Mut 3′UTR 表达载体。按实验分组进行转染，48 h 后裂解细胞，根据荧光素酶检测试剂盒提供的方法检测hRluc 及hLuc+的荧光强度，二者的比值反映miR-96 与Sox 3′UTR 的结合情况。

1.6 Western blot 检测Sox6 蛋白 实验分组同1.2，细胞处理24 h 后，以PBS 液洗涤细胞，加入RIPA 裂解液冰上裂解30 min，4 ℃离心10 min，取上清液。以BCA 蛋白定量试剂盒行蛋白浓度测定，调整蛋白浓度平衡后，按体积计算加入5×SDS凝胶加样缓冲液，95 ℃加热15 min。10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，12 V 恒压半干转膜45 min 后，丽春红染色5 min 观察转膜效果。5%脱脂牛奶封闭2 h，按1∶1 000 加入兔抗鼠Sox6 一抗（Abcam 公司），4 ℃孵育过夜，TBS-T 洗3 次，1∶5 000 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育2 h，TBST 洗3 次，用Tanon 5500 免疫荧光检测系统激发荧光，摄取图像及条带光密度值分析。

1.7 统计学方法 实验数据以3 次实验的平均值±标准差表示，通过SPSS 18.0 软件分析实验数据，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-96 对MIN6 细胞胰岛素合成与分泌的影响 MIN6 细 胞 转 染miR-96 mimic 或inhibitor 能 够有效增加或降低细胞内miR-96 表达水平（图1A）。转染miR-96 mimic 组Ins2 mRNA 及胰岛素分泌量表达较对照组明显增加（P＜0.01），miR-96 inhibitor 组Ins2 mRNA 及胰岛素分泌量较对照组有下降（P＜0.01）。各组细胞Ins1 mRNA 表达量变化差异不明显（图1B、1C）。GSIS 实验发现转染miR-96 mimic 组细胞胰岛素分泌量较对照组有显著增加，而转染miR-96 inhibitor 组细胞胰岛素分泌量较对照组有显著减少（P＜0.05，图1D）。

图1 miR-96 对MIN6 细胞Ins1、Ins2 mRNA 表达及胰岛素分泌的影响Fig.1 Effect of miR-96 on the expression of Ins1，Ins2 mRNA and the secretion of insulin in MIN6 cells

2.2 生物信息学预测miR-96 靶向结合Sox6 3′UTR 应用Targetscan，MiRbase 等在线软件进行miR-96 靶标预测显示其与Sox6 3′UTR 存在很好的靶向结合位点（图2A），提示miR-96 可能参与Sox6 表达调控。使用RNAhybrid 在线网站分析人/鼠miR-96 与Sox6 3′UTR 结合自由能情况，结果显示miR-96 与Sox6 3′UTR 结合自由能很低，提示miR-96 具有较强的体内结合Sox6 3′UTR 的能力（图2B、C）。

2.3 miR-96 靶向结合Sox6 3′UTR 情况 构建Sox6 3′UTR 的野生型及突变型荧光素酶报告基因表达质粒，与miR-96 共转染到293T 细胞，荧光素酶活性检测发现miR-96 可明显抑制psiCHECKTM-2-Sox6-WT 3′UTR 的 表 达（P＜0.05），而 对psi-CHECKTM-2-Sox6-MU 3′UTR 表达无影响，表明miR-96 可靶向结合胞内Sox6 mRNA 的3′UTR，从而抑制Sox6 的表达（图3）。

2.4 miR-96 下调MIN6 细胞Sox6 mRNA 及蛋白的表达miR-96 mimic 组Sox6 mRNA 及蛋白表达较对照组明显降低（P＜0.01），miR-96 inhibitor 组Sox6 mRNA 及蛋白表达较对照组明显增加（P＜0.01）。表明miR-96 可抑制MIN6 细胞Sox6 mRNA及蛋白的表达（图4A、B）。

3 讨论

2 型糖尿病发病的核心环节主要包括胰岛素抵抗和胰岛分泌不足，其中β细胞功能衰竭在2 型糖尿病的进展过程中起关键作用［5］。正常β细胞功能的维持受一系列基因及细胞内信号通路的精确调控，其中胰岛素基因转录调控因子在维持胰岛β细胞功能，促进胰岛素合成与分泌的过程中发挥重要作用，目前研究［6-7］发现的胰岛素转录促进因子主要包括Pdx1、NeuroD、Pax6、Nkx2.2、Islet1 及Nkx6.1 等，而转录抑制因子则包括Sox6、Bhlhe22、Stx3、Hes1、Crem、Insm1 及Insm2 等，其相互之间的动态平衡是维持机体血糖稳态所必需的。

图2 miR-96 与Sox6 3'UTR 结合位点及结合自由能分析Fig.2 The predicated binding sites and binding free energy between miR-96 and the 3′UTR of Sox6

图3 miR-96 与Sox6 3′UTR 荧光素酶报告基因载体共转染293T 细胞后的相对荧光强度Fig.3 Luciferase activity assay of 293T cells cotransfected with a luciferase reporter plasmid containing the Sox6 3′UTR and miR-96 mimic for 24 h

最近研究表明microRNAs 可以通过调控胰岛素转录因子的表达而参与维持机体糖平衡。microRNA（miRNA）是一类参与基因转录后调控的非编码小分子RNA，在胰腺β细胞增殖、发育、胰岛素合成与释放及糖尿病并发症的发生发展过程中发挥重要作用［8-10］。大量microRNA，如：miR-375、miR-204、miR-7、miR-26、miR-236、miR-217等已被证实参与胰腺发育、胰岛素合成与分泌等过程［11-13］。MATTHEW 等［14］通过筛选在胰岛细胞特异性高表达的miRNAs 发现miR-96 在胰岛细胞高表达，可能与胰岛素分泌有关，但miR-96 在胰岛细胞中的具体作用目前尚不明确。

早期研究发现在Dicer1 缺失的β细胞中，胰岛素转录调控抑制因子Sox6 的表达水平显著升高。本文通过一系列实验研究发现，导致Ins2 转录及胰岛素分泌增加，而对Ins1 的影响并不明显。由于miR-96 与Ins2 mRNA 的3′UTR 并无直接靶向作用位点，因此我们分析miR-96 可能通过作用于Ins2 的转录调控因子进而促进Ins2 的表达。通过生物信息学分析，笔者找出了Sox6 与miR-96 的作用位点，即Sox6 mRNA 3′UTR 的553-561 位，进一步实验证实，miR-96 可直接抑制Sox6的表达。

由于Ins1 与Ins2 基因启动子区序列的差异，Sox6 与Ins1 启动子上游调控序列并无有效的结合位点，因此本研究观察到Ins1 mRNA 表达受miR-96 影响并不明显，但是由于在小鼠胰岛β细胞中，Ins2 的表达量是Ins1 的9 倍［15］，因此，Ins2 基因转录水平的上调可导致胰岛素分泌增加。

本研究虽然发现了一种新的参与胰岛素分泌的miRNA，并阐明了其具体作用机制，为miRNAs在糖尿病治疗中找到了新靶点，但利用miRNAs 作为药物靶点仍存在很多困难，一方面，miRNAs 类似物并不稳定，且很难准确的到达作用靶点。另一方面，许多生物制剂及药物都对miRNAs 在细胞中的表达有影响。后续研究将会深入探讨miR-96作为药物靶点在活体的应用，为糖尿病的预防及治疗提供可行的新思路。

图4 miR-96 对Sox6 mRNA 及蛋白表达的影响Fig.4 The effect of miR-96 on the expression of Sox6 mRNA and protein