付芳惠 付希安 王真真 于功奇 刘 红 张福仁

IL36Ra是IL-36α、IL-36β及 IL-36γ的受体拮抗剂，通过与IL-36受体结合抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB) 信号通路及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 途径下游促炎信号的活化[1]。自2011年Marrakchi等人首次报道IL36RN突变导致IL-36Ra的功能减弱或丧失，引起泛发性脓疱型银屑病(GPP)的发生后，多项遗传学研究发现其突变具有种族异质性[1-4]。随后，有学者对IL36RN与局限性脓疱型银屑病的相关性进行讨论，包括掌跖脓疱病(palmoplantar pustulosis，PPP)和连续性肢端皮炎(acrodermatitis continua of Hallopeau，ACH)[5]。PPP是一种局限于掌跖部位的慢性炎症性皮肤病，临床表现为红斑基础上周期性发生的无菌性脓疱，伴角化、鳞屑。目前，关于IL36RN与PPP的相关性存在争议。Mössner等[6]发现在欧洲人群中IL36RN与PPP不相关。日本学者对88例PPP患者的IL36RN基因测序报道了相似的结果[7]。然而，在14例中国PPP中发现2例患者携带c.115 + 6T>C突变[2]。为进一步明确IL36RN与中国人群PPP的相关性，我们收集了96例PPP患者和144名健康志愿者，对其进行了IL36RN基因测序，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 为2014年1月至2017年12月在我院就诊的96例PPP患者和144名健康志愿者。病例组和对照组的平均年龄分别为(51.23±11.94)岁和(50.05±11.12)岁。病例组的男女比例为1∶3，对照组为5∶11。两组之间年龄和性别差异均无统计学意义。所有患者由我院2名经验丰富的皮肤科专家根据临床表现和组织病理确诊。本研究得到了山东省皮肤病性病防治研究所伦理委员会的批准。所有参与者均签署知情同意书。

1.2实验方法

1.2.1 基因组DNA提取 用EDTAK2抗凝管抽取5mL外周静脉血，根据TGuide大体积血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)操作步骤提取外周全血DNA。使用全波长紫外/可见光扫描分光光度计ND-8000(NanoDrop公司)测定DNA浓度及纯度，根据DNA原液浓度将DNA原液标化为30 ng/μL的DNA模板。

1.2.2 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增 使用NCBI(National Center of Biotechnology Information)/Primer-BLAST对IL36RN(参考号NM_012275.2)全部外显子及其两端侧翼序列设计扩增引物，由北京华大基因研究中心合成，引物序列详见表1。PCR采用12.5μL反应体系：Taq Mix(包括dNTP、Taq酶和缓冲液)6.5μL，灭活的去离子水ddH2O 5μL，上下游引物(F+R)0.5μL，模板DNA 0.7 μL。反应条件:94℃预变性10 min：94℃变性30 s，退火45s(退火温度详见表1)，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

1.2.3 DNA测序 采用乙醇醋酸钠纯化法纯化所有阳性扩增条带的样本。分离纯化后的DNA采用双脱氧链终止法(Sanger测序法)，在ABI 3500XL DNA测序分析仪(美国Applied Biosystem公司)上进行基因测序。用Chromas软件对测序结果进行分析，并将测序结果与NCBI下载的参考序列同时输入NCBI Nucleotide BLAST中进行比对分析。

1.3 统计学方法 数据分析采用SPSS软件包22.0版本处理。除了描述性数据，定量资料若符合正态分布，以(均数±标准差)表示，若不符合，则以中位数和四分位间距(IQR)表示或百分比(频率)表示。定性资料采用Pearson’s卡方检验或Fisher’s精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 本研究共包括96例PPP患者，其中男24例，女72例，男女比例为1∶3 ，平均发病年龄为(49.53±12.07)岁。

2.2 IL36RN测序结果 对96例PPP患者和144名健康对照者进行IL36RN基因测序，共检测到2个已知的突变位点：c.115+6T>C(p.Arg10ArgX1)杂合突变和c.140A>G(p.Asn47Ser)杂合突变。见图1。96例PPP患者中有6(6.3%)例患者携带突变，其中3例患者携带c.115+6T>C， 3例携带c.140A>G。144名健康对照者中共有6(4.2%)名携带突变，2名携带c.115+6T>C，4名携带c.140A>G。PPP组与健康对照组IL36RN突变率比较,差异无统计学意义(P=0.67，OR=0.65，95%CI:0.20～2.09)。

图1 a：c.115+6T>C 杂合突变；b：c. 140A>G 杂合突变

外显子引物序列5’-3’退火温度(℃)片段大小(bp)2上游5-’CTCAGCCTCTCTCTCCATGATT-3’下游5’-CGGGTCTATCCAGAACTCACTT-3’581643上游5’- TGCTGTTACTTCTGGCACAGT-3’下游5’-CCAAGGAAAGTGGGTCATGT-3’582494上游5’-CTGCTGAGAAGCCTCCCTTC-3’下游5’-CTGAGTCCCCAGTGAGGATG-3’582935上游5’-GATTCTGTTGATGGCAGCTTT-3’下游5’-CATGGGTCTCCTCCACTCAC-3’58396

3 讨论

PPP是一种以掌跖部位反复发生无菌性脓疱为特征的炎症性皮肤病，好发于中老年女性，其发病率为0.05%～0.1%[8]。本研究中PPP平均发病年龄为(49.53±12.07)岁，女性是男性的3倍，与之前的文献报道相似[9]。

PPP的病因和发病机制尚不清楚，研究证实遗传因素在疾病的发生发展中发挥重要作用[10]。由于PPP和GPP同属于脓疱型银屑病，因此有学者把GPP的致病基因在PPP中进行验证。2011年Marrakchi等利用纯合子定位和直接测序法对9个GPP突尼斯家系进行研究，发现IL-36RN是常染色体隐性遗传GPP的致病基因。IL36RN属于IL-1家族，主要在皮肤中表达，编码 IL36受体拮抗剂(IL36-Ra)。IL36-Ra通过与IL-1受体样2受体(IL-1RL2)结合，参与激活促炎症信号NF-κB及和MAPK信号转导通路，阻碍IL-36细胞因子(IL-36α、IL-36β、IL-36γ)炎症作用。当IL36RN发生突变时，其编码的IL-36Ra结构发生改变，对 IL-1RL2的拮抗能力减弱甚至丧失，而IL-36α、IL-36β、IL-36γ与IL-1RL2的结合则相应增加，通过激活下游促炎症信号通路，最终引起皮肤的炎症反应[1，11]。2013年Setta-Kaffetzi等在139例欧洲PPP患者中发现7例携带IL36RN突变，证实PPP与IL36RN相关[5]。2015年Mössner的研究团队对251例欧洲PPP患者进行IL36RN基因的筛查，检测到4例患者携带突变。虽然基于Setta-Kaffetzi等研究的等位基因频率和效应量，该研究有大于99.999%的效能来检测PPP与IL36RN突变等位基因之间的关联，但是其研究并没有得到IL36RN突变与PPP发病相关的证据支持[6]。随后，日本团队也报道IL36RN突变不是PPP的决定性致病因素[7]。然而，有学者在14例中国PPP中发现2例患者携带c.115 + 6T>C突变[2]。为进一步明确IL36RN与中国人群PPP的相关性，我们对96例中国汉族PPP患者和144名健康对照进行IL36RN测序，发现PPP组与健康对照组IL36RN突变率相比,差异无统计学意义(P=0.67，OR=0.65，95%CI:0.20～2.09)。本研究中PPP组和正常对照组中c.140A>G的突变等位基因频率分别为0.015和0.013。在人类遗传变异数据库( Human Genetic Variant Database)的1142个样本中共50个携带c.140A>G杂合突变，突变等位基因频率为0.022。PPP组与二者相比，差异均无统计学意义，因此我们认为此突变与PPP不相关。c.115 + 6T>C是亚洲人群中最常见的突变，位于IL36RN基因3号外显子下游的内含子区域，突变影响3号外显子的剪接，导致截短蛋白的合成，影响IL36Ra的功能[12]。我国台湾学者曾报道此突变与PPP相关，其OR值为15.8[2]。本研究在96例PPP患者中发现3例携带c.115+6T>C，基于台湾学者研究中的等位基因频率和效应量，我们有88.76%的效能检测突变与PPP的相关性。我们的研究并不支持IL36RN基因与PPP发病相关，与欧洲、日本的研究结果一致。