李秀红

【关键词】大鼠;电刺激;脊髓损伤;神经生长因子;神经修复

在中枢神经系统中，脊髓部位极易受损。而脊髓损伤可严重影响人的脊柱健康，致残率高，甚至危及患者生命。目前，脊髓损伤后的神经修复仍属于世界性难题，神经生长因子作为神经营养因子的典型代表，其可在一定条件下促进未损伤神经元出芽，从而有利于被破坏神经回路的重建。因此，神经生长因子对脊髓损伤后的重建发挥着重要作用。电刺激是通过发出接近人体生物电的微量电流来促进神经生长因子的表达，从而促进受损神经元恢复、修复脊髓损伤。本实验旨在观察电刺激对大鼠脊髓损伤后神经生长因子表达的影响，从而为临床治疗提供借鉴。

1材料与方法

1.1实验动物选取健康成年SD大鼠48只，体重（196±20.3）g，雌雄不限。所有大鼠分笼饲养，饲养环境温度在20～25℃。随机分成3组，正常组（n=16）、电刺激组（n=16）和损伤对照组（n=16），各组再分成造模后1d、3d、5d、7d亚组，每个亚组4只。

1.2方法

1.2.1制备动物模型：电刺激组及损伤对照组大鼠均腹腔注射1.5%戊巴比妥钠45mg/kg进行麻醉，并给予背部剃毛、消毒，并切开皮肤及皮下组织，使得棘突与椎板暴露，将T9椎板咬除，然后采用冲击棒在高度为25mm处使大鼠自由坠落致使脊髓损伤，缝合伤口。精心护理并独笼饲养，并给予协助排尿、抗菌、补充体液，预防压疮、感染等，一直持续到大鼠取材，正常组切除相应椎板并给予切口缝合。

1.2.2电刺激：电刺激组大鼠于术后24h开始给予经皮电刺激，每次30min，1次/d，直至取材。采用疏密波脉冲电流，选择中档电流强度，以10Hz为刺激频率，负极与右下肢小腿位置的皮肤连接，正极与损伤部位上缘约2cm处皮肤连接。

1.2.3取材：术后1d、3d、5d、7d时对各组大鼠进行取材，采用高剂量戊巴比妥钠过度麻醉大鼠，然后左心室插管、右心耳剪开，灌注冰生理盐水、肝素钠，见右心耳流出澄清液后再灌注4%多聚甲醛1h，将椎弓管打开，切除T7-T11段脊髓，并进行固定，24h后进行脱水、修片、切片、贴片、烤片，处理完成后备用。

1.2.4免疫组织化学染色：采取非生物素二步法对神经生长因子免疫组化染色，先将各组切片脱蜡、梯度酒精水化，然后高压热抗原修复，封闭内源性过氧化物酶及特异性抗原，再将NGF抗体滴入后冰箱过夜。采用兔抗鼠二抗在温度为37℃恒温状态下孵育1h，加DAB-H2O2显色液到切片，室温环境下反应并采用显微镜观察，然后漂洗、复染、脱水，树胶封片。通过显微镜观察神经生长因子表达，见棕黄色反应为阳性。

1.3观察指标观察脊髓内神经生长因子阳性产物的分布情况，并对各组脊髓内、中、外的神经生长因子阳性细胞数进行统计，测量其平均积分光密度值。

1.4数据处理采用SPSS19.O，用（π±s）表示计量资料，采用方差分析及t检验，P<0.05为差异有显著性。

2结果

见表1，电刺激1d时，电刺激组的神经生长因子平均积分光密度值及阳性神经元数相对于正常组和损伤对照组有所增加，但无显著性差异（P>0.05）;电刺激3d、5d、7d时电刺激组和损伤对照组的上述两项指标显著高于正常组（P<0.05），电刺激5d、7d时，电刺激组的上述两项指标显著高于损伤对照组和正常组（P<0.05）。

3讨论

研究证实，神经元轴突生长及定向致靶状况以及神经元的存活质量是脊髓损伤后功能恢复的重要影响因素。神经生长因子属于神经营养素家族中的重要一员，其来源于靶组织，并对神经元产生逆向营养作用，对促进靶器官与皮质脊髓束建立联系有重要作用，而且可逆转受损神经元的萎缩，从而提高神经元存活率，促进受损神经的修复。

本实验结果显示，电刺激开始后，随着电刺激时间的延长，电刺激组的神经生长因子表达成上升趋势，电刺激3d、5d、7d时电刺激组和损伤对照组的神经生长因子平均积分光密度值及阳性神经元数显著高于正常组，电刺激5d、7d时，电刺激組的上述两项指标显著高于损伤对照组和正常组（P<0.05），本实验结果提示两点：一是脊髓损伤后，神经生长因子分泌增加，相比未发生脊髓损伤组呈现高表达;二是电刺激治疗有助于刺激神经生长因子分泌，进一步增加其在脊髓损伤部位的含量。研究显示，中枢神经系统受损后，其神经生长因子加速分泌，从而发挥其维持受损部位神经元存活、促进神经纤维再生等作用，可见，神经生长因子在促进受损神经元修复方面发挥着重要作用。研究证实，对于中重度脊髓损伤来说，在没有外界干预情况下，受损机体的内源性神经生长因子表达量并不能完全达到保护和修复神经元的水平，而且其维持时间较短。因此，不少学者提出通过增加外源性神经生长因子的表达来满足受损机体神经元修复所需，从而促进受损神经元的快速康复，本实验结果证实了这一建议的可行性。实验中发现，经皮电刺激治疗将微量电流的正负极分别与T 9右侧夹脊穴和右下肢足三里穴相连接，从而在受损区周围搭建了一个外在电场，通过电流刺激来提高神经生长因子的分泌。本实验中发现，神经生长因子免疫反应阳性物多集中于大鼠灰质前角神经元内，并多数定位于细胞核和胞浆中，说明电刺激后刺激受损区域有助于增加其神经生长因子的分泌，与以往文献结果一致。

综上所述，脊髓损伤后电刺激能够诱导大鼠损伤区神经生长因子的表达，这将为损伤区神经元的恢复创造有利的微环境。