林书祥，潘蕊，舒剑波，孟英韬，邹映雪，彭林

(1天津市儿童医院·天津市儿科研究所，天津300134；2天津市第四中心医院)

手足口病(HFMD)是儿科常见病毒感染性疾病，由多种肠道病毒(EV)引起，具有高度传染性。HFMD通常是一种良性的自限性疾病，但少部分患者也可出现神经、呼吸或循环系统严重并发症，甚至会导致死亡。HFMD为我国C类法定传染病，发病率和病死率在2017年的45种法定传染病中居首位。EV是一种正义单链RNA病毒，其类型有13种，从A型到J型，鼻病毒A、B、C型。HFMD是通过粪口途径、直接或间接接触鼻腔和喉咙的分泌物进行传播[1]。HFMD感染的主要病原体为EV71和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)，不同型别EV感染导致的HFMD临床特点可能有所不同[2]。但近年来由CVA6和CVA10导致的HFMD在中国[3～6]、法国[7]、泰国[8]发病逐年增多，因此非EV71和非CVA16的其他EV引起的HFMD也需引起足够重视。本研究收集2014～2016年天津市儿童医院住院HFMD患儿的标本，对HFMD进行鉴定并对其感染的主要病原体进行分型，有助于临床对本病的诊治。

1 对象与方法

1.1 调查对象 选择2014～2016年在天津市儿童医院住院并成功留取粪便标本的HFMD患儿499例，诊断标准参照HFMD诊疗指南(2010年版)[9]。其中男320例，女179例，男女比例为1.79∶1；年龄21 d～14岁。患儿家长知情同意，研究经医院伦理委员会批准。

1.2 标本采集、处理及保存 采集患儿入院3 d内的大便标本，置于专用无菌便盒，4 ℃暂存，12 h内送达实验室后于-80 ℃冰箱保存。取标本500 μL，加入等量生理盐水，配制50%的混悬液，充分振荡混匀，5 000 r/min离心10 min，取上清用于病毒检测。

1.3 EV检测方法 采用RT-PCR法。采用核酸提取及扩增试剂盒(江苏默乐生物科技有限公司)，用RT-PCR法使用荧光定量PCR仪(ABI Prism7500)检测核酸中的EV通用型、EV71和CVA16。操作步骤：配制工作液，上下颠倒混匀；在洗涤液WA瓶中加入无水乙醇4.8 mL，颠倒混匀6次以备用；洗涤液WB瓶中加入无水乙醇9.2 mL，颠倒混匀6次以备用。取1.5 mL离心管做好标记后分别加入已混匀的工作液209 μL；用带滤芯无RNase的吸头加入需抽提处理的样本和对照品200 μL，分别加入蛋白酶K 50 μL，振荡混匀，短暂离心，72 ℃静置10 min；用带滤芯吸头加入裂解液100 μL，振荡混匀，短暂离心；将核酸抽提柱置于2 mL离心管上，将液体转移入核酸抽提柱，12 000 r/min离心30 s。弃废液，在每个核酸抽提柱内加入洗涤液WA 500 μL，12 000 r/min离心30 s；弃废液，在每个核酸抽提柱内加入洗涤液WB 450 μL，12 000 r/min离心30 s。弃废液，以最大转速离心2 min。将核酸抽提柱置于无RNase的离心管，膜中央加入EB 40 μL，静置1 min，12 000 r/min离心2 min。弃纯化柱，将离心回收的核酸储存于4 ℃待检。配制反应体系，计算各试剂使用量，加入离心管中，充分混匀，简短离心，向设定的RT-PCR反应管中分别加入20 μL，转移至样本处理区。在装有PCR反应液的反应管中分别加入制备好的标本5 μL，同时做质控样本和阴性对照RT-PCR反应。反应条件：45 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s 40个循环，58 ℃ 40 s。

1.4 EV阳性标本衣壳蛋白VP1(VP1)区全长基因扩增和序列检测 将阳性EV标本按照QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司，德国)的操作说明提取标本上清中的RNA，按照PrimeScripiT One Step RT-PCR Kit Ver 2(Takara公司，日本)操作说明进行EV分型检测，根据文献合成EV分型引物AN32、AN33、AN34、AN35、224、222、AN89、AN88[10]。实验体系及过程参见Nix WA和Oberste MS的研究过程[10]。实验过程中使用PICO 21微量离心机(美国Thermo公司)，C1000梯度DNA扩增仪，NC-001电泳仪，及Universal HoodⅡ凝胶成像仪均购自美国BIO-RAD公司。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果，选取琼脂糖凝胶电泳鉴定结果阳性的PCR产物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果与Genbank数据库中的序列进行比对分析，获得EV的分型。

1.5 生物信息学分析 多序列比对分析采用MEGA6.06，使用邻近法，选择Kimura 2-parameter模型，构建亲缘进化树，通过1000 bootstrap评估建树的可靠性。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计数资料以例或百分比表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EV阳性检出情况 EV71的阳性率为46.5%(232/499)，CVA16的阳性率为5.4%(27/499)，NENC的阳性率为34.07%(170/499)，三者比例为8.6∶1∶6.3，EV总阳性率为85.97%(429/499)。

2.2 EV阳性标本VP1区基因扩增及测序结果 499份标本中共检出21种EV，EV71阳性率最高，为46.5%(232/499)；其次为CVA10，阳性率9.4%(47/499)；其余EV：CVA6阳性35份、CVA16阳性27份、CVA12阳性11份、埃可病毒9型(Echo9)阳性7份、柯萨奇病毒B组3型(CVB3)阳性5份、Echo18阳性3份、Echo6阳性3份、CVA2阳性3份、柯萨奇病毒B组1型(CVB1)阳性3份、CVA4阳性2份、CVA9阳性2份、埃可病毒30型(Echo30)2份、CVA5阳性1份、CVA8阳性1份、CVA24阳性1份、Echo16阳性1份、Echo25阳性1份、CVB2阳性1份、CVB5阳性1份。尚有40份标本未能成功测序分型。

2.3 系统进化情况 运用MEGA6.06软件邻近法将本研究此次测序的28份EV71型标本的VP1序列与EV71各型及亚型代表株序列构建系统进化树，可见EV71毒株均与C4a亚型处于同一进化分支，属于C4a亚型。扩增104份非EV71非CVA16 EV的VP1编码序列，共获得47份CVA10的VP1序列，随机选取22份，根据VP1序列构建进化树，22份CVA10聚集成簇，构成G型。扩增104份非EV71非CVA16的EV VP1编码序列，共获得35份CVA6的VP1序列，随机选取16份，根据VP1序列构建进化树，16份CVA6聚集成簇，构成F型。

3 讨论

HFMD是儿童常见的自限性传染病，自2008年我国暴发HFMD以来，EV71及CVA16即成为HFMD的主要病原体[11,12]。但近年来，由CVA6和CVA10引起的HFMD病例也逐渐增多，出现零星发生或暴发增加，或将取代EV71及CVA16成为主要病原体，在导致HFMD的散发和暴发中造成越来越大的影响。

尽管EV的多种基因型和亚型可同时或循环在其他国家和地区发病[8,13～16]，但研究显示EV71仍然是导致2014～2016年天津地区HFMD发生的主要EV。EV71在世界各地以循环方式暴发，且该病毒每2～3年就会感染大量免疫能力不足的儿童。通过对进化树的构建及分析，发现EV71与以往报道结果相同[17,18]，仍属C4a亚型。HFMD是一种温和的自限性疾病，EV71与其他EV相比更易导致脑膜脑炎、肺出血、循环衰竭甚至死亡。因此，仍需长期全面监测EV71。

据报道，CVA10感染早在1981年就在日本暴发[19]。近年来，CVA10感染发生率在我国山东、河北和湖北在内的多个地区不断上升，这使其成为中国HFMD的常见病毒[12,20,21]。CVA10已成为HFMD的主要病原体之一，近年来常被发现与其他EV共同流行，这对预防和控制HFMD构成了挑战。本研究中虽只有47份标本CVA10阳性，但其阳性率仅次于EV71。通过对进化树的构建及分析发现CVA10的序列排列聚集成7个集群(A～G)。本研究中的22份CVA10与Zhang等[22]报道的G型参考株聚集成簇，其中G型集群绝大多数参考株来自2009年以后的中国大陆包括山东、河北、上海等地，而A～E型来自2010年及以前的日本、俄国、法国、印度等地，F型来自2008年及以前的中国大陆地区。由此可见，近年来CVA10在我国导致的HFMD正呈现逐年增多的趋势，需引起重视。根据病毒出现的时间序列和系统发育关系，可对未来会持续流行的病毒进化枝或亚枝进行粗略预测，以便更准确地预防与诊断疾病。

CVA6是另一种重要的血清型病毒。虽然CVA6感染通常是轻度和自限性的，以咽喉溃疡为特征的疱疹性咽峡炎和皮肤症状为特征的HFMD最为常见。CVA6感染的大多数病例与严重的皮肤表现和甲状腺肿瘤有关[23]。本研究CVA6阳性35份，阳性率仅次于EV71和CVA10，居第3位。通过对进化树的构建及分析发现，随机选取的16份CVA6的序列排列聚集成6个集群(A～F)，其中本研究中的16份CVA6聚集成簇构成F型，F型集群的参考株来自2008～2012年的西班牙、芬兰、法国、古巴、日本等国家及2011～2013年的上海、广东、泰州和苏州等中国大陆地区；A～E型来自1992年的山东及1994～2010年的美国、印度、日本、法国等。通过进化树可以粗略观察近年来世界各地CVA6流行的病毒亚型已发生改变，这对今后的疫苗研究及疾病的防控有重要意义。

综上所述，2014～2016年天津市儿童医院499例HFMD患儿共检出21种不同的EV，虽然EV71的阳性率仍最高，但非EV71非CA16的其他EV类型也占据一定比例。因此需长期全面监测，及时发现新型别病毒，以预防感染并控制疾病流行。