陈蕾，李泉，高文风，孟洁，王爱红，王占聚

(潍坊医学院附属医院，山东潍坊261031)

细胞间黏附分子1(ICAM-1)是黏附分子家族重要成员之一，不仅参与免疫细胞的识别和活化，还广泛参与各种炎症反应[1]。近年来研究发现，ICAM-1在多种肿瘤细胞中也有表达，在肿瘤细胞的侵袭与转移中发挥重要作用[2]。我们前期研究发现，ICAM-1在人淋巴瘤Raji细胞中高表达。为进一步研究ICAM-1在淋巴瘤中的作用，2018年2～6月，我们构建了ICAM-1基因慢病毒干扰载体，包装慢病毒并感染人淋巴瘤Raji细胞，抑制ICAM-1在Raji细胞中的表达，并观察Raji细胞迁移及侵袭能力的变化，以期为淋巴瘤的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 质粒pLKO.1-ICAM-1shRNA-GFP、psPAX2、pMD2.G、HEK293T细胞及人淋巴瘤细胞Raji为潍坊医学院附属医院血液科实验室常规保存；RPMI-1640培养基以及小牛血清购自杭州四季青公司；RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR试剂均购自大连TaKaRa公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司；BCA蛋白浓度测定试剂、质粒提取试剂、小鼠抗人β-actin单克隆抗体以及ECL发光试剂均购自碧云天生物技术研究所；兔抗人ICAM-1单克隆抗体、HRP标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG购自CST公司；Transwell检测小室购自COSTAR公司，Matrigel胶购自BD公司；ICAM-1及β-actin引物由博尚生物技术公司合成。

1.2 慢病毒包装及病毒滴度测定 人ICAM-1慢病毒载体的构建参照前期实验方法[3]。常规培养HEK293T细胞并取对数生长期的细胞进行实验，待HEK293T细胞汇合度达70%时转染质粒并进行慢病毒包装。慢病毒重组载体pLKO.1-ICAM-1shRNA-GFP质粒6 μg、psPAX2质粒4 μg、pMD2.G质粒2 μg，加入opti-MEM至总体积300 μL，另取opti-MEM加入LipofectamineTM2000 36 μL至总体积300 μL，将上述液体混匀后缓慢加入含HEK293T细胞培养皿中，6 h后补足完全培养液至10 mL，48 h后收集细胞上清液并用0.45 μm滤器过滤，高速离心浓缩后得到ICAM-1慢病毒浓缩液，同法获得无干扰能力的阴性对照病毒浓缩液。将HEK293T细胞接种于96孔板中并调整细胞为1×104/孔，将病毒浓缩液倍比稀释后依次感染HEK293T细胞，24 h后以完全培养基代替病毒液继续培养，观察绿色荧光蛋白表达情况，计算病毒滴度(表达荧光的细胞数×稀释倍数)，并确定最佳感染复数(MOI)。荧光显微镜下可见细胞发出明亮绿色荧光，48 h后收集富含病毒颗粒的细胞上清液。测定病毒液感染HEK293T细胞的病毒滴度，计算病毒滴度为2×108TU/mL。取MOI为5、10、20的慢病毒液感染HEK293T细胞，荧光显微镜下可观察到细胞发出明亮绿色荧光，表明慢病毒成功感染靶细胞。

1.3 Raji细胞内ICAM-1基因沉默 常规培养Raji细胞并按照1×105/孔的密度接种于6孔板中，随机分为空白对照组、NC组及干扰组。培养24 h后进行病毒感染，空白对照组不加处理，另两组加入相应病毒液。将所制备慢病毒以5×MOI进行感染，加入终浓度为8 mg/L的聚凝胺以提高感染效率。感染8 h后换液并继续培养，3 d后得到稳定感染的细胞。

1.4 细胞内ICAM-1 mRNA检测 采用RT-PCR技术。TRIzol抽提Raji细胞总RNA并合成cDNA，取逆转录产物2 μL行PCR 扩增。引物序列：ICAM-1上游引物5′-ATGCCCAGACATCTGTGTCC-3′、下游引物5′-GGGGTCTCTATGCCCAACAA-3′；β-actin上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′、下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′。扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min，ICAM-1扩增长度为112 bp，β-actin扩增长度为416 bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并拍照，用凝胶成像系统与Quantity one软件进行图像分析，以β-actin做内参照，以目的基因与β-actin的灰度比值计算mRNA相对表达量。

1.5 细胞内ICAM-1蛋白表达检测 采用Western blotting法。离心收集Raji细胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h，离心收集蛋白并测定浓度，蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉溶液室温孵育封闭2 h，加入兔抗人ICAM-1抗体(1∶1 000)和小鼠抗人β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)和HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，室温孵育2 h，TPST洗膜3次，ECL化学发光法显色，显影定影后将胶片拍照，Image J软件行灰度值分析，以ICAM-1与内参β-actin蛋白灰度值比值计算蛋白相对表达量。

1.6 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。以1×105/mL的细胞密度将各组Raji细胞接种于包被有Matrigel的96孔板中，内含10%胎牛血清的培养液常规培养，直至形成细胞单层。采用无菌枪头在培养板底部单层培养细胞上划痕，洗涤3次后加入无血清培养液继续培养，加入10 g/mL丝裂霉素排除细胞增殖干扰，细胞划痕后48 h在显微镜下观察并测量细胞平均迁移距离，与0 h的初始距离作对比，计算细胞平均迁移率。细胞划痕迁移率=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次，取平均值。

1.7 细胞侵袭能力检测 采用Transwell实验。Transwell小室内膜加入Matrigel胶并置于24孔板中，待胶凝固后实验。取Raji细胞并调整细胞浓度为1×105/mL，200 μL/孔将细胞悬液加入Transwell小室，同时在Transwell下室中加入含10%小牛血清的培养基800 μL，37 ℃培养24 h后取出小室，用棉签擦拭内膜上的细胞，预冷甲醇固定30 min后弃掉甲醇，1%结晶紫染色20 min，倒置显微镜下随机观察5个视野并计数穿膜细胞数。重复实验3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组ICAM-1 mRNA表达比较 干扰组、NC组及空白对照组ICAM-1 mRNA相对表达量分别为0.29±0.06、1.12±0.05、1.05±0.02，干扰组ICAM-1 mRNA相对表达量低于NC组、空白对照组(P均<0.05)。

2.2 各组ICAM-1蛋白表达比较 干扰组、NC组及空白对照组ICAM-1蛋白相对表达量分别为0.35±0.06、1.07±0.01、1.01±0.04，干扰组ICAM-1蛋白相对表达量低于NC组、空白对照组(P均<0.05)。

2.3 ICAM-1基因沉默对Raji细胞迁移能力的影响 干扰组、NC组及空白对照组细胞迁移率分别为为35.92%±3.73%、64.25%±3.18%、61.25%±5.01%，干扰组细胞迁移率低于NC组、空白对照组(P均<0.05)。

2.4 ICAM-1基因沉默对Raji细胞侵袭能力的影响 干扰组、NC组及空白对照组细胞穿膜数分别为(63.40±6.54)、(74.20±4.09)、(78.60±1.52)个/视野，干扰组细胞穿膜数少于NC组、空白对照组(P均<0.05)。

3 讨论

淋巴瘤是血液系统常见的恶性肿瘤之一，其在中国的发病率远高于西方国家，严重危害人们的健康。虽然近年来对淋巴瘤的治疗有了长足进步，但每年仍有大量患者死于淋巴瘤的转移和复发[4]。目前研究表明，淋巴瘤的复发与转移与细胞黏附分子有密切关系，细胞黏附分子通过促进肿瘤细胞与血管内皮细胞及细胞外基质细胞的黏附，在肿瘤细胞的转移中发挥重要作用[5,6]。

ICAM-1是细胞黏附分子家族中的重要成员，其配体是淋巴细胞功能相关抗原1，参与各种细胞之间的黏附与识别[1,7,8]。有研究证实，ICAM-1在多种肿瘤细胞中均有表达，ICAM-1通过促进肿瘤细胞吸附于血管内皮细胞或淋巴管内皮细胞表面，促进肿瘤细胞的转移，在肿瘤发生发展过程中起重要作用。ICAM-1在多种肿瘤组织中呈高表达，且ICAM-1高表达的肿瘤患者多数预后较差[9～13]。有研究证实原癌基因Kras可促进胰腺腺泡细胞中ICAM-1表达，通过募集巨噬细胞在炎症部位聚集促进癌前病变的形成[14]。转化生长因子β(TGF-β)可提高ICAM-1表达促进骨肉瘤细胞的转移[15]。下调ICAM-1表达或阻断ICAM-1信号通路，可降低小鼠结肠癌细胞和乳腺癌细胞的远端转移能力[16,17]。有研究表明ICAM-1在淋巴瘤患者中呈高表达，并且与肿瘤细胞自分泌和血管内皮细胞旁分泌有关。ICAM-1促进肿瘤细胞通过血液系统或淋巴系统转移扩散，并促进淋巴瘤的发生发展[18,19]。有研究表明，ICAM-1可增强B细胞向脾和结外组织的迁移、极化和归巢，最终通过激活核因子κB(NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶-丝/苏氨酸蛋白激酶信号途径促进B细胞向恶性转化。ICAM-1还可介导中性粒细胞对各种淋巴瘤细胞的杀伤作用。T细胞淋巴瘤细胞可通过病毒调节蛋白Tax和NF-κB信号通路降低ICAM-1的表达，从而逃避机体免疫系统的识别与杀伤，阻断ICAM-1的表达可有效抑制淋巴瘤细胞的转移[20～23]。提示ICAM-1在淋巴瘤的发生发展过程中也起关键作用。

慢病毒介导的RNA干扰是近年来发展起来的一项新技术，能特异而有效地干扰靶基因的表达，具有转染率高、稳定性高及特异性强等特点[24]。我们前期研究发现，ICAM-1在人淋巴瘤Raji细胞内高表达，为进一步研究并探讨ICAM-1在淋巴瘤转移中的作用，我们利用前期构建成功的ICAM-1慢病毒干扰载体[3]，用三质粒包装系统进行慢病毒包装并感染人淋巴瘤Raji细胞，抑制ICAM-1在Raji细胞中的表达并观察细胞迁移侵袭能力的变化。结果证实ICAM-1慢病毒可有效下调Raji细胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表达；细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果证实下调ICAM-1表达后肿瘤细胞的迁移与侵袭能力均下降。提示靶向沉默ICAM-1基因表达可抑制人淋巴瘤Raji细胞的迁移与侵袭，研究结果有望为淋巴瘤的临床治疗提供新的思路与靶点。

综上所述，沉默ICAM-1基因可抑制人淋巴瘤Raji细胞的迁移与侵袭。但本研究尚未明确具体的分子作用机制，将在今后的研究中进一步探讨。