王 瑜，徐广民，曾 思，张 鹏，雷 迁

(四川省医学科学院·四川省人民医院麻醉科，四川 成都 610072)

脑缺血预处理可诱导脑细胞及神经元对持续性缺血的耐受，可能会预防和保护缺血再灌后的脑损伤[1，2]。有研究证实了脑缺血预处理(IPC)诱导耐受现象的器官普遍性[3]。研究发现部分内源性物质，也可以诱导类似脑缺血耐受的发生，例如脂多糖(LPS)预处理可以诱导大鼠脑缺血耐受，显示有部分神经保护作用，但其作用机制尚不清楚[4～6]。2016年9月至2018年9月我院开展研究，探讨脂多糖应答分子LRG参与内毒素预处理诱导的脑缺血耐受的作用机制，为临床治疗脑缺血性疾病提供可行性理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料①实验动物：健康8周龄C57雄性小鼠80只，清洁级，体重(22±3)g，购自四川省人民医院实验动物研究所。②实验试剂：MTT、LPS、DMSO(Escherichia coli，O111：B4)均购自于美国Sigma公司；0.25%Trypsin-0.02%EDTA、DMEM/F12、抗生素均购自于赛默飞公司；胎牛血清购自四季青公司；小鼠TNF-α、IL-6、TNF-1β ELISA试剂盒均购自深圳达科为生物技术有限公司。③实验仪器：带针缝合线(中国强生医疗器械有限公司)；AL104电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司公司)；SZM45体视显微镜(深圳博宇)； R4100酶联免疫检测仪(Dynateeh，美国)；超声细胞破碎仪(Sonics&Meterials公司)；MicroCL 21R 离心机(Thermo Scientific，德国)；power PAC 2000电泳仪(Biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠脑皮质原代细胞神经元的分离培养 取新生健康小鼠(<24 h)，75%冰乙醇浸泡10 min，在无菌环境下断头处死，快速取出大脑组织，置于冷的D-PBS中。将0.25%胰蛋白酶加入到彻底剪碎的脑组织中充分消化后，用DMEM-F12(含10%FBS)培养制成单细胞悬液。再将其接种在培养瓶中(密度1×106个/ml)，并置于培养箱中培养。4 h后，将种植液换成神经元基础培养基，继续维持培养，隔3天以半量神经元基础培养基换液(实验方法参照文献[7])。

1.2.2LPS预处理后检测神经元细胞中LRG分子的蛋白水平 分离出纯化的神经元细胞，在6孔板上以1×106/孔的密度做细胞培养，并分为control组、LPS直接刺激组、LPS预刺激组。其中预刺激组先用0.01 μg/ml脂多糖预刺激18 h，然后用1 μg/ml脂多糖再刺激6、24、48 h。……