唐应麒 ，杨 艳，曾 峰，程晓明

(1.遵义医科大学附属医院 甲状腺乳腺外科，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学附属医院 检验科，贵州 遵义 563099)

甲状腺癌(Thyroid carcinoma，TC)是目前发现的最常见内分泌系统恶性肿瘤[1]，根据病理类型主要分为乳头状甲状腺癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)、滤泡状甲状腺癌(Follicular thyroid carcinoma，FTC)、未分化型甲状腺癌(Undifferentiated thyroid carcinoma，UTC)和髓样癌(Medullary thyroid carcinoma，MTC)[2]。TC近年的发病率在全球范围内呈持续上升趋势[3]，TC发病率的升高主要是以PTC发病率的增加为主[4]。同其他恶性肿瘤一样，TC的发病可能与基因的表达异常有关，如BRAF、TERT、LASS2等[5-8]。人源性长寿保障基因2(Homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2)，也被称为肿瘤转移抑制相关基因1(Tumor metastasis suppressor gene-1，TMSG-1)，是一种人类肿瘤转移抑制基因。已有研究表明，LASS2的异常表达与肝癌[9]、前列腺癌[10]、膀胱癌[11]、乳腺癌[12]的发生发展有关，但LASS2与甲状腺癌关系的研究却鲜有报道。随着对TC发病机制不断研究，目前已有针对BRAF、RET/PTC、RAS等基因的靶向治疗[13]。即便如此，甲状腺癌的发病机制仍然不清，靶向治疗具有一定局限性，所以需要更进一步探寻其他可能存在的分子机制及分子标记物，为临床诊治提供新的思路。本课题通过构建LASS2过表达的BCPAP细胞，研究LASS2对BCPAP细胞迁移侵袭的影响及其可能存在的机制，为TC的诊治提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 BCPAP细胞株购自中科院干细胞库；Adv-LASS2-GFP、Adv-GFP重组腺病毒购自北京百奥川生物科技有限责任公司；RPMI 1640培养基购自GIBCO公司；RNA提取试剂盒、RT-qPCR试剂购自Takara公司；GAPDH购自华安生物技术有限公司；全蛋白提取试剂盒、Matrigel购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自雅酶生物科技公司；逆转录试剂盒购自北京GenStar公司；实时荧光定量PCR仪(ABI7500)购自美国ABI公司；Gel Doc XR+凝胶成像仪购自美国BIO-RAD公司；Transwell小室购自美国Corning公司；倒置显微镜(iX71)购自日本Olympus公司；GAPDH抗体购自华安公司；LASS2抗体购自Santa公司；MMP2、MMP9抗体购自abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染 BCPAP细胞采用含10%FBS、1%NEAA、1%丙酮酸钠、1%Glutamax的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，当密度达80%～90%时进行转染，Adv-LASS2-GFP、Adv-GFP分别感染BCPAP细胞，分为实验组(Adv- LASS2-GFP，n=3)、空载组(Adv-GFP，n=3)和阴性对照组(n=3)，转染48h后按各实验目的进行收样。所有实验重复3次。

1.2.2 RT-qPCR检测LASS2 mRNA表达情况 转染48h后，提取各组细胞中总RNA，测定RNA浓度与纯度，并逆转录合成cDNA，储存于-80℃冰箱中备用。以GAPDH作为内参，RT-qPCR检测分析LASS2 mRNA相对表达水平(扩增体系25μL，反应条件95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；融解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)，以2-ΔΔCt值表示基因相对表达量。目的基因引物序列：GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；LASS2上游5′-ATCGTCTTCGCCATTGTT-3′，下游5′-AGCAGTGGAAGCCTTACTCC-3′。

1.2.3 WB检测LASS2、MMP2、MMP9蛋白相对水平 转染48 h后，按照全蛋白提取试剂盒说明提取各组细胞总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，根据说明用2%SDS和上样缓冲液将蛋白稀释至2 μg/μL，蛋白变性后，每个泳道上样量20 μg，10%SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，4℃湿转过夜、封闭、洗膜、一抗(鼠抗LASS2单克隆抗体稀释倍数1∶500，鼠抗GAPDH单克隆抗体稀释倍数1∶5 000，兔抗MMP2多克隆抗体稀释倍数1∶2 000，兔抗MMP9多克隆抗体稀释倍数1∶2 000)4℃孵育过夜、洗膜、二抗(羊抗鼠、羊抗兔二抗稀释倍数均为1∶4 000)室温孵育2 h，洗膜、成像，测量条带灰度值并统计数据，计算LASS2蛋白、MMP2、MMP9相对表达量。

1.2.4 体外迁移、侵袭实验

1.2.4.1 细胞迁移实验 用无血清RPMI 1640培养基培养细胞24 h，消化、离心并重悬，调整细胞浓度为5×105/mL，混匀后取200 μL细胞悬液接种于Transwell小室上室，下室加入500 μL含20%FBS的培养基，轻轻摇匀后置入培养箱中继续培养24 h，取出Transwell小室，倒置风干，各孔加入适量0.1%结晶紫，染色30 min，PBS清洗并置显微镜下观察，随机选取3个视野，拍照计数。每组设定3个复孔。

1.2.4.2 细胞侵袭实验 将Matrigel基质胶置4℃条件下过夜融化，无血清RPMI 1640培养基与Matrigel按1∶8比例稀释，混匀后均匀包被Transwell小室上室，37 ℃培养箱中继续培养120 min，使Matrigel聚合成胶，按细胞迁移实验步骤培养细胞24 h，取出Transwell小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，移去Transwell，倒置，风干，各孔加入适量0.1%结晶紫，染色30 min，PBS清洗并置显微镜下观察，随机选取3个视野，拍照计数。每组设定3个复孔。

1.2.5 细胞划痕实验 将细胞接种于6孔板中(密度1×105/孔)，置培养箱中培养，次日细胞集合率为70%，用无菌100 μL枪头垂直于板面沿培养板底划线，弃培养基且PBS清洗3次，加入新鲜培养基后显微镜下记录0h划痕宽度，各组细胞分别转染Adv-GFP、Adv-LASS2-GFP并继续培养24 h，测量迁移距离。实验重复3次。

2 结果

2.1 RT-qPCR、WB法验证过表达LASS2 BCPAP细胞构建成功 Adv- LASS2-GFP 、Adv-GFP转染BCPAP细胞48 h后分别用RT-qPCR、WB法检测3组细胞内LASS2 mRNA及蛋白的表达量，结果示：Adv-LASS2-GFP组细胞中LASS2 mRNA及蛋白的表达水平均明显高于NC组和Adv-GFP组，提示：过表达LASS2 BCPAP细胞构建成功(见图1)。

*：Adv-LASS2-GFP组分别与NC组、Adv-GFP组相比，P<0.05。图1 RT-qPCR、WB分别检测各组LASS2 mRNA及蛋白相对表达水平

2.2 过表达LASS2对BCPAP细胞体外侵袭能力的影响 细胞体外侵袭实验结果示：与NC组、Adv- GFP组穿膜的细胞数(46.67 ±2.08、50.67 ±1.53)相比，Adv-LASS2-GFP组穿膜细胞的数(19.00±3.61)明显降低，P<0.05。NC组与Adv-GFP组无明显差异(P均>0.05)。结果表明：过表达LASS2可以有效抑制BCPAP细胞体外侵袭能力(见图2)。

*：Adv-LASS2-GFP组分别与NC组、Adv-GFP组相比，P<0.05。图2 体外侵袭实验检测各组穿膜的细胞数

2.3 过表达LASS2对BCPAP细胞体外迁移能力的影响 细胞体外迁移实验结果示:与NC组、Adv- GFP组的穿膜细胞数(88.67±4.04、86.00 ±5.00)相比，Adv-LASS2-GFP组穿膜的细胞数(44.67±3.06)明显降低，P<0.05。NC组与Adv-GFP组无明显差异(P均>0.05)。结果表明：过表达LASS2可以有效抑制BCPAP细胞体外迁移能力(见图3)。

*：Adv-LASS2-GFP组分别与NC组、Adv-GFP组相比，P<0.05。图3 体外迁移实验检测各组穿膜的细胞数

2.4 过表达LASS2对BCPAP细胞划痕的影响 细胞划痕实验结果显示：各组细胞培养24 h后， Adv-LASS2-GFP组细胞的划痕宽度(198.33±6.51 μm)明显高于NC组、Adv- GFP组细胞的划痕宽度(92.67±3.51 μm、91.67±4.51μm)，P<0.05。NC组与Adv-GFP组无明显差异(P均>0.05)。结果表明：过表达LASS2可以有效抑制BCPAP细胞体外迁移能力(见图4)。

*：Adv-LASS2-GFP组分别与NC组、Adv-GFP组相比，P<0.05。图4 细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力

2.5 过表达LASS2对MMP2、MMP9表达的影响 Western blot 检测结果显示：Adv-LASS2-GFP组MMP2、MMP9蛋白的表达量明显低于NC组、Adv- GFP (P<0.05，见图5)。结果提示：过表达LASS2能抑制BCPAP细胞MMP2、MMP9蛋白的表达。

*：Adv-LASS2-GFP 组分别与 NC 组、Adv-GFP 组相比，P<0.05。图5 过表达LASS2对MMP2及MMP9的影响

3 讨论

TC的发病率逐年升高，发病隐匿，部分患者确诊时已发生侵袭或转移，TC发生侵袭和转移会影响患者预后及术后治疗，研究TC侵袭及迁移的作用机制对TC在临床上的诊治有一定意义。TC的侵袭和转移受多种因素影响，有研究表明，STAT3(传导及转录激活因子3基因)、HOBX9等基因可抑制TC细胞迁移及侵袭能力[17-18]，BRAF基因、CRNDE基因(结直肠肿瘤差别表达基因)等基因促进TC细胞迁移及侵袭[19-20]。TC细胞的迁移及侵袭能力可能是通过PI3K/AKT、Wnt等信号通路被调节[21-24]。

LASS2是一种肿瘤转移抑制基因，在细胞增殖、细胞侵袭和细胞迁移方面起到抑制的作用，并且还可以促进细胞凋亡[14]，目前研究均认为LASS2是通过调节神经酰胺合成、与囊泡型ATP依赖型质子泵(V-ATPase质子泵)的结合来发挥其功能。LASS2可以诱导神经酰胺合成酶的活性，通过神经酰胺的生物学作用抑制肿瘤细胞生长[15]，与V-ATPase的c亚基(ATP6L)相互作用可抑制V-ATPase活性，使细胞外H+减少可抑制肿瘤转移、侵袭能力，同时细胞内H+累积可促进肿瘤细胞凋亡[16]。但LASS2与TC侵袭和转移关系的相关研究相对较少。相关研究[10]表明沉默LASS2基因增加了V-ATPase活性及细胞外H+浓度，进而激活分泌MMP-2和MMP-9分泌，导致增强前列腺癌(PCa)细胞的侵袭和转移；在Zeng等[ 25]关于LASS2和PTC的研究中，发现过表达LASS2抑制PTC细胞增殖，并通过p53依赖性途径引起BCPAP细胞G0/G1期阻滞。上述表明LASS2和PTC密切相关，但具体机制如何？MMP2、MMP9 是否作为调节因子参与其中？仍待进一步研究。

为研究LASS2对PTC侵袭、迁移的影响，本实验采用Adv重组腺病毒载体构建人源重组LASS2腺病毒表达载体，通过构建过表达LASS2的BCPAP细胞，并将Adv-GFP、Adv-LASS2-GFP 腺病毒表达载体分别转染 BCPAP细胞，分别采用 qRT-PCR和WB实验验证LASS2在BCPAP细胞中过表达成功。分别设立实验组(Adv-LASS2-GFP)、空载组(Adv-GFP)和阴性对照组(NC)BCPAP细胞，进而研究LASS2过表达对甲状腺癌BCPAP 细胞迁移侵袭的影响。我们首先观察到过表达LASS2对BCPAP细胞体外侵袭能力的影响，结果表明：过表达LASS2有效抑制了BCPAP细胞的侵袭能力(P<0.05)；同样，在过表达LASS2对BCPAP细胞迁移能力影响实验中得到类似结果，(P<0.05)；最后在划痕实验中观察到LASS2上调能够明显抑制细胞迁移能力(P<0.05)。这与游海燕等[26]通过体外细胞实验研究LASS2对肝癌HCCLM3的生物学影响的结果类似。

基质金属蛋白酶(MMP)主要作用于肿瘤周围的细胞外基质和基底膜的IV型胶原和明胶，其中MMP2、MMP9是作用较强的一种,在多数肿瘤中均有一定表达。相关研究[27]结果表明，LASS2抑制细胞侵袭、迁移的机制可能与MMP-2和MMP-9有关，周少飞[28]发现甲状腺癌组中MMP2、MMP9的表达均明显增高，表明MMP2、MMP9和PTC的相关性。为研究LASS2抑制细胞迁移侵袭是否与MMP2、MMP9异常表达有关，我们采用WB检测BCPAP细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的相对表达情况，实验结果提示：MMP-2和MMP-9在LASS2过表达组中的蛋白相对表达水平较Adv-GFP组和NC组中明显下调(P<0.05)，表明过表达LASS2抑制BCPAP细胞的侵袭和迁移可能与MMP-2和MMP-9下调相关。

综上所述，过表达的LASS2能有效抑制BCPAP细胞侵袭和迁移，作用机制可能与MMP-2和MMP-9表达下调相关，可能作为PTC的治疗提供潜在的治疗靶点。