王长鹰,李 军

(1西安国际医学中心心脏内科,西安 710075;2空军军医大学第二附属医院心血管内科;*通讯作者,E-mail:junliafmu@126.com)

严重烧伤早期,心肌细胞因有效循环血容量不足即可发生缺血缺氧并导致能量代谢失衡。早期的心肌损伤是导致严重烧伤后心脏功能障碍的主要原因,继而可进一步引起烧伤后机体血流动力学紊乱,加重烧伤后的休克状态,甚至诱发多器官功能衰竭[1-3]。因此,在严重烧伤的早期救治过程中,注重对心肌损伤的防护是保护心脏功能和改善患者预后的重要保证。

金丝桃苷(hyperoside,Hyp),又名槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷,是一种从金丝桃属或山楂属等植物中提取出的黄酮醇苷类化合物。药理学研究表明,金丝桃苷具有多种生物学活性,如抗氧化、抗炎、抗高血糖、抗肿瘤等,并且对肝损伤、心脑缺血、感染、肿瘤等多种疾病都具有一定的治疗效果[4,5]。但Hyp能否减轻机体严重烧伤后的心肌损伤未见相关报道,因此,本研究通过构建Ⅲ度烧伤大鼠模型,观察Hyp对严重烧伤大鼠早期心肌损伤的作用并初步探究其分子机制,为临床治疗提供一定的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

8周龄雄性SD大鼠60只,清洁级,体质量200-250 g,空军军医大学动物实验中心提供,动物生产许可证号:SCXK(军)2007-007号。金丝桃苷(Hyp)和EX527购自美国Sigma公司。肌钙蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)ELISA试剂盒购自美国USCN life公司。超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。小鼠抗大鼠髓过氧化物酶(MPO)单克隆抗体购自美国LifeSpan Biosciences公司。anti-SIRT1、anti-Ac-foxo1、anti-gp91phox、anti-Nox4、anti-IL-6、anti-IL-1β和anti-Cleaved Caspase-3抗体购自美国Abcam公司,anti-β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 动物分组及处理

将60只雄性SD大鼠(200-250 g)随机分为4组：假烧伤组(sham组)、烧伤组、金丝桃苷处理组(Hyp组)和金丝桃苷处理加抑制剂组(EX527+Hyp组)，每组15只。大鼠经戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，背部脱毛仰卧位固定于特制的烫伤装置上，仅将其背部浸入到98°C的热水15 s，以造成30%体表面积Ⅲ度烫伤，构建烧伤动物模型;sham组大鼠则将背部浸入到25 ℃水中15 s。烧伤结束后，立即腹腔注射乳酸林格液(50 mg/kg)进行液体复苏，并在烧伤后6 h补充注射乳酸林格液1次[6]。Hyp组和EX527+Hyp组大鼠在烧伤后0，3，6 h灌胃给予Hyp(30 mg/kg)处理，sham组和烧伤组则给予相同剂量的生理盐水灌胃；EX527+Hyp组大鼠在药物灌胃处理后同时给予腹腔注射EX527(5 mg/kg)处理。

1.3 心肌力学指标监测

在烧伤后12 h,通过右侧颈总动脉将一根细导管插入大鼠左心室,然后将导管另一端与BL-420生理信号采集处理系统压力换能器相连接,待大鼠呼吸心率稳定后记录左心室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左心室内压最大上升速率(+dP/dtmax)和左心室内压最大下降速率(-dP/dtmax),并计算出左室发展压(left ventricular developmental pressure,LVDP=LVSP-LVEDP)。

1.4 心脏HE染色

大鼠心脏标本经10%甲醛固定、酒精脱水处理后石蜡包埋,然后制成5 μm厚心脏切片,常规HE染色,光学显微镜拍照观察。

1.5 心肌损伤生化指标检测

各组大鼠颈动脉取血后静置并离心获得血清标本,经血生化分析仪测定心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine phosphokinase-isoenzyme-MB,CK-MB)的含量。

1.6 心肌炎性因子水平测定

按照ELISA试剂盒说明书加入标准品,同时每个待测样品设置2个复孔,待反应终止后用酶标仪测定各孔吸光密度值并绘制标准曲线,分别计算各组大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.7 心肌组织中性粒细胞染色

将制备好的心脏石蜡切片经脱蜡复水操作和PBS液洗涤后，分别滴加100 μl小鼠抗大鼠MPO单克隆抗体，4 ℃过夜孵育，DAB显色和苏木精复染后封片，显微镜观察并拍照记录MPO在心脏组织中的阳性表达情况，进而明确各组中性粒细胞(MPO+)在心脏组织中的浸润情况。

1.8 心肌抗氧化物含量测定

测定心肌组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)来评价各组大鼠刺激后的心肌组织抗氧化能力。严格按照试剂盒说明书检测组织匀浆中SOD和GSH水平,并用分光光度法测量吸光度值以计算出抗氧化物的含量。

1.9 Western blot检测蛋白表达水平

提取各组大鼠心脏总蛋白后定量,按每孔40 μg上样量将各组蛋白经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离,并通过湿转法转移至PVDF膜上。将切好的各条带用5%的脱脂牛奶室温下封闭2 h,封闭完成后孵育在SIRT1(1 ∶1 000)、Ac-foxo1(1 ∶1 000)、Nox4(1 ∶1 000)、gp91phox(1 ∶1 000)、IL-6(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶3 000)的抗体管中,4 ℃过夜。TBST摇洗条带3次,再使用辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶4 000)室温孵育2 h,TBST洗涤条带3次,通过Bio-Rad系统成像并Image Lab软件分析结果。

1.10 统计学分析

所有数据以均数±标准差表示,通过单因素方差分析(ANOVA)对多个组进行比较。用Prism 5.0程序对数据进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌力学指标比较

大鼠心肌力学监测指标显示,与sham组相比,烧伤组大鼠的LVDP、+dP/dtmax与-dP/dtmax均显著降低(P<0.05);给予金丝桃苷处理后,Hyp组大鼠的LVDP、+dP/dtmax与-dP/dtmax值显著升高(与烧伤组相比,P<0.05);而使用SIRT1特异性阻断剂EX527则会明显逆转Hyp对心肌力学参数的保护作用(P<0.05,见图1)。

与sham组相比,#P<0.05,##P<0.01;与烧伤组相比,**P<0.01;与Hyp组相比,△△P<0.01图1 大鼠心肌力学指标比较Figure 1 Comparison of myocardial mechanical indexes among four groups

2.2 心肌损伤形态学及生化指标比较

大鼠心脏切片HE染色显示,与sham组相比,烧伤组大鼠心肌纤维排列紊乱,波浪样改变,甚至出现肌束分离、断裂现象;Hyp组较烧伤组大鼠心肌纤维排列紊乱的现象显著改善,纤维断裂显著减少;而使用SIRT1特异性阻断剂EX527则会明显逆转Hyp对心肌损伤的保护效果(见图2)。各组大鼠血清标本经血生化检测显示,与sham组相比,烧伤组大鼠cTnI和CK-MB均显著升高(P<0.05);给予金丝桃苷处理后,Hyp组大鼠的cTnI和CK-MB值显著降低(与烧伤组相比,P<0.05);而使用SIRT1特异性阻断剂EX527则会明显逆转Hyp对心肌损伤生化指标的改善(P<0.05,见图2)。

与sham组相比,#P<0.05,##P<0.01;与烧伤组相比,**P<0.01;与Hyp组相比,△△P<0.01图2 大鼠心肌组织HE染色及坏死标志物含量比较 (×400)Figure 2 HE staining of myocardium and the contents of necrotic markers in each group (×400)

2.3 心肌炎性水平比较

心肌炎性水平检测结果显示,与sham组相比,烧伤组大鼠血清中炎症因子TNF-α和IL-1β的含量显著增加,心肌组织中性粒细胞浸润明显,IL-6和IL-1β蛋白表达量显著升高(P<0.05);给予金丝桃苷处理后,Hyp组大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量显著降低,心肌组织中性粒细胞浸润明显减轻,IL-6和IL-1β蛋白表达显著受抑制(与烧伤组相比,P<0.05);而使用SIRT1特异性阻断剂EX527则会明显逆转Hyp的上述保护作用(P<0.05,见图3-5)。

与sham组相比,#P<0.05,##P<0.01;与烧伤组相比,**P<0.01;与Hyp组相比,△△P<0.01图3 大鼠心肌组织中性粒细胞浸润情况比较 (×400)Figure 3 Comparison of the infiltration of neutrophilic granulocyte in myocardial tissue in each group (×400)

与sham组相比,#P<0.05,##P<0.01;与烧伤组相比,**P<0.01;与Hyp组相比,△△P<0.01图4 大鼠血清中炎症相关因子含量比较Figure 4 Comparison of the contents of inflammatory-related factors in rat serum among four groups

与sham组相比,#P<0.05,##P<0.01;与烧伤组相比,**P<0.01;与Hyp组相比,△△P<0.01图5 大鼠心肌组织炎症相关因子蛋白表达比较Figure 5 Comparison of the protein expression of inflammatory-related factors in myocardial tissue among four groups

2.4 心肌组织氧化应激水平比较

心肌组织氧化应激水平检测结果显示,与sham组相比,烧伤组大鼠心肌组织中抗氧化物SOD和GSH水平显著降低,氧化应激标志蛋白Nox4和gp91phox的表达量明显升高(P<0.05);给予金丝桃苷处理后,Hyp组烧伤大鼠心肌组织中SOD和GSH水平显著增加,Nox4和gp91phox的蛋白表达量明显下降(与烧伤组相比,P<0.05);而使用SIRT1特异性阻断剂EX527则会明显逆转Hyp的上述保护作用(P<0.05,见图6,7)。

与sham组相比,#P<0.05,##P<0.01;与烧伤组相比,**P<0.01;与Hyp组相比,△△P<0.01图6 大鼠心肌组织抗氧化物含量比较Figure 6 Comparison of the contents of antioxidants in myocardial tissue among four groups

与sham组相比,#P<0.05,##P<0.01;与烧伤组相比,**P<0.01;与Hyp相比,△△P<0.01图7 大鼠心肌组织氧化应激标志蛋白表达比较Figure 7 Expression of oxidative stress marker proteins in myocardial tissue in each group

2.5 心肌SIRT1信号及凋亡蛋白表达的比较

Western blot检测结果显示,与sham组相比,烧伤组大鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达明显下降,Foxo1的乙酰化水平明显升高,同时凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达明显上调;给予金丝桃苷处理后,Hyp+烧伤组大鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达明显升高,Foxo1的乙酰化水平明显下降,同时cleaved Caspase-3蛋白表达明显下调;而使用SIRT1特异性阻断剂EX527则会明显逆转Hyp的上述保护作用(P<0.05,见图8)。

与sham组相比,#P<0.05,##P<0.01;与烧伤组相比,**P<0.01;与Hyp组相比,△△P<0.01图8 大鼠心肌组织SIRT1信号表达水平Figure 8 Expression of SIRT1 signaling in myocardial tissue in each group

3 讨论

近年来,研究已证实严重烧伤可诱发心脏损伤,且烧伤后的机体常伴有明显的心肌收缩力减弱,严重时会导致心功能障碍,极大地影响了患者的预后。严重烧伤后心功能的改变主要表现在心肌力学功能和心肌微观结构的变化上,如心输出量和心指数的下降、中心静脉压和肺毛细血管楔压的升高、以及心肌酶谱改变和心肌细胞水肿等方面[7,8]。本研究结果同样证实,大鼠Ⅲ度烧伤后心肌力学监测指标显示,与sham组相比,烧伤组大鼠的LVDP、+dP/dtmax与-dP/dtmax均显著降低。同时,烧伤组大鼠心肌坏死标志物cTnI和CK-MB均显著升高。此外,大鼠心脏微观结构显示,与sham组相比,烧伤组大鼠心肌纤维排列紊乱,波浪样改变,甚至出现肌束分离、断裂现象。由此得出,在临床烧伤一线的救治过程中,注重对机体心脏功能的保护,将能明显改善严重烧伤患者的预后。

氧化应激损伤在严重烧伤后的心肌损伤中起着关键的作用,活性氧簇可导致心肌细胞膜脂质和胞内蛋白质过氧化,以及心肌细胞DNA损伤和内源性抗氧化酶的耗尽,并最终导致心肌细胞死亡和器官损伤[9,10]。机体内氧自由基的清除与活性氧簇生成间的失衡已成为严重烧伤后的心肌损伤的机制之一。此外,炎症也在严重烧伤引起的心脏损伤中扮演着重要的角色,中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞以及TNF-α,IL-1β、IL-6等促炎因子均可响应有害刺激而引发强烈的炎症反应,大量研究已表明,这些炎症细胞和促炎因子在严重烧伤后的心脏表达中明显上调[11,12]。因而有效抑制严重烧伤后心肌细胞的氧化应激水平和炎症反应是保护心脏功能的重要举措。

金丝桃苷是一种从植物中提取的类黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗高血糖和抗凝血等多种生物学效应[13]。大量研究报道金丝桃苷在多种损伤因素所致的心血管损害中均发挥重要的保护作用,并且与其抗氧化和抗炎效应密切相关[14,15]。王成等[16]研究发现,金丝桃苷可通过激活PI3K/AKT/Nrf2信号通路保护心肌细胞免受高糖诱导的氧化应激损伤。舒庆等[17]系统综述了金丝桃苷可通过细胞外信号调节激酶通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路、抗氧自由基和一氧化氮自由基的形成、抑制钙离子内流等分子机制,发挥减轻心肌缺血/再灌注损伤的作用。李春阳等[18]报道,金丝桃苷预处理人脐静脉血管内皮细胞能显著抑制ACE酶活性和炎症因子含量的增加,具有一定的抗炎和舒血管作用。本研究同样观察到,严重烧伤后,与sham组相比,烧伤组大鼠心肌组织氧化应激水平与炎症反应明显增强,而给予金丝桃苷处理后,能显著促进烧伤大鼠心肌组织中抗氧化物的生成并抑制炎症细胞以及炎症相关因子的释放,从而减轻了心肌损伤。

作为一种关键的内源性心血管疾病保护分子[19,20],SIRT1因其明显的抗氧化与抗炎特性在心肌损伤保护中均扮演着重要角色,并且有研究发现激活SIRT1信号可以显著减轻严重烧伤引起的炎症反应[21],因而,本课题组猜想SIRT1信号在严重烧伤大鼠早期心肌损伤中是否同样发挥保护性作用。本研究结果首先观察到,与sham组相比,烧伤组大鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达明显下降,Foxo1的乙酰化水平明显升高,同时凋亡蛋白cleaved Caspase-3表达明显上调。因此,严重烧伤大鼠所致的早期心肌损伤与心肌组织中SIRT1蛋白降低可能密切相关。此外,有研究报道SIRT1可介导多种抗氧化物质发挥心肌保护作用[22-24],并且高健美等[25]发现金丝桃苷对D-半乳糖致衰老小鼠具有抗氧化作用,其作用可能通过调控SIRT1/Nrf2信号通路相关。张婷等[26]发现金丝桃苷能通过激活SIRT1基因,抑制NF-κB基因保护高糖所致的人神经母细胞瘤细胞的氧化损伤,那么金丝桃苷是否能通过激活SIRT1信号从而减轻烧伤后的心脏损伤有待于进一步探究。本研究结果进一步证实,给予金丝桃苷处理后,Hyp组大鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达明显升高,Foxo1的乙酰化水平明显下降,同时明显下调cleaved Caspase-3的蛋白表达。而使用SIRT1特异性阻断剂EX527则会明显逆转金丝桃苷对烧伤后大鼠心脏功能、心肌组织微观形态、心肌坏死标志物、心肌组织氧化应激损伤以及炎症反应的保护作用,从而进一步验证了金丝桃苷减轻烧伤后大鼠心肌损伤的可能内源性分子机制。

综上所述,金丝桃苷可通过抗氧化应激损伤与抗炎作用减轻严重烧伤大鼠早期心肌损伤,其分子机制可能与其激活SIRT1信号通路有关。