杨正生,张路芳,代秀荣,林宁宁,宋铁军

(秦皇岛市第一医院皮肤科,秦皇岛 066000;*通讯作者,E-mail:ylxd785@126.com)

银屑病是一种慢性炎症性疾病,其发病机制复杂,目前的研究结果表明,很多病理因素参与其中。银屑病的发病是一个动态的过程,细胞的免疫应答在其中起着至关重要的作用,而其中细胞因子对于免疫细胞的活化以及信号通路的激活起到了重要的桥梁作用。近来的研究表明[1],Th22(T辅助细胞22)细胞因子IL-22参与了炎症性细胞的免疫过程,能够活化某些重要的细胞信号通路,同时能够维护表皮的完整性。信号转导与转录激活因子3(STAT3)在角质形成细胞增殖以及银屑病的发病过程中起到非常重要的作用[2]。姜黄素作为一种天然提取的物质,能够在急慢性炎症性疾病中起到重要的免疫调节作用。姜黄素能够抑制很多皮肤炎症反应以及过氧化物、环氧化酶等炎症因子的表达[3]。由于姜黄素具有良好的抗炎及免疫调节特性,目前在很多免疫性疾病的治疗中具有广阔的应用前景。本研究利用永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)作为研究对象,首先明确IL-22对角质形成细胞STAT3磷酸化蛋白表达的影响,进而研究姜黄素对IL-22诱导的STAT3磷酸化的干预作用,从而明确姜黄素对细胞因子诱导下的某些细胞信号通路活化的干预作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 永化生人角质形成细胞株(HaCaT细胞,中国典型培养物保藏中心)。

1.1.2 主要试剂及仪器 姜黄素(美国Sigma公司);RPMI1640培养基(美国Invitrogen公司);重组人IL-22(美国Perotech公司);p-STAT3(Tyr705)兔抗人单克隆抗体(美国Cell Signal公司);STAT3兔抗人多克隆抗体、β-actin、羊抗兔二抗(美国Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将永生化角质形成细胞株HaCaT细胞,培养在RPMI1640培养基中(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml链霉素),培养箱条件:含5%浓度的CO2,温度37 ℃。细胞贴壁生长后传代,一般选取给予2-4代的细胞进行后续干预实验。

1.2.2 实验分组 在HaCaT细胞处于对数生长期时,将细胞消化后吹打成单细胞悬液,然后按照1×105/ml接种于细胞培养板,待到细胞完成70%-80%融合时,更换为无血清培养基继续培养24 h后进行下一步实验:首先在不同时间点(0,5,15,30,60 min)加入IL-22(20 ng/ml)后用Western blot法检测磷酸化STAT3和总STAT3的蛋白表达情况(n=3)。此外,将细胞分为5组,即姜黄素4个不同浓度预处理组以及对照组。即在加入IL-22刺激细胞前1 h加入不同浓度的姜黄素(0,2.5,5,10 μmol/L),另设对照组只加培养基。

1.2.3 蛋白免疫印迹(Western blot法)检测p-STAT3和STAT3蛋白表达 处理和干预HaCaT细胞后,用预冷的PBS液体洗3遍,每孔加1 ml RIPA裂解液+5 μl PMSF(100 mmol/L)+5 μl磷酸化酶抑制剂(100 mmol/L),摇匀置于冰上。收集细胞,裂解液离心后检测蛋白浓度后进行后续实验。取上清,10%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳。放置好电极,安装好转印装置,按300 mA稳流，转膜40 min,转膜后的膜分别用兔抗人p-STAT3、STAT3(二者均为1 ∶2 000稀释)4 ℃孵育过夜后洗涤,加用二抗(羊抗兔,1 ∶500稀释)室温孵育2 h,ECL暗室曝光显色。丽春红S染色5-10 min(肉眼可见转膜是否成功),ddH2O漂洗数次,将染色完全清洗干净。

1.2.4 统计学方法 数据以均数±标准差表示;采用SPSS 15.0软件进行统计学分析,多组比较用单因素方差分析(ANOVA)和q检验。以α=0.05为检验水准;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-22对HaCaT细胞p-STAT3蛋白表达的影响

在未接受刺激之前,HaCaT细胞几乎没有磷酸化STAT3(p-STAT3,Tyr705位点)的表达。但经IL-22体外培养的刺激后,HaCaT细胞中p-STAT3表达随着刺激时间延长,明显增强,根据Western blot的检测结果,用IL-22(20 ng/ml)刺激HaCaT细胞30 min时达到最高峰,60 min时p-STAT3的表达略有下降的趋势(见图1)。

图1 IL-22刺激不同时间后HaCaT细胞中p-STAT3蛋白表达Figure 1 Expression of p-STAT3 in HaCaT cells after treatment with IL-22 for different time

2.2 姜黄素对IL-22诱导的HaCaT细胞中p-STAT3蛋白表达的影响

实验结果表明,姜黄素能够明显下调IL-22诱导的HaCaT细胞中p-STAT3的表达(P<0.01),而对总STAT3的表达则无明显影响(见图2),提示姜黄素剂量依赖性地下调HaCaT中p-STAT3/STAT3的比值,随着浓度增加,这一数值逐渐降低。

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;与IL-22组比较,#P<0.05,##P<0.01图2 姜黄素对IL-22诱导的p-STAT3蛋白表达影响Figure 2 Effect of different concentrations of curcumin on expression of p-STAT3 in HaCaT cells induced by IL-22

3 讨论

银屑病是一种慢性皮肤炎症性疾病,其重要的病理学特点为角质形成细胞的异常的增殖和分化,造成这一现象的原因非常复杂,目前认为一些炎症性细胞因子在其中发挥了重要的作用。

STAT家族最初是作为一种DNA结合蛋白被发现,被认为参与了某些干扰素依赖的基因表达的调控。STATs在未被激活前通常存在于胞浆中,在受到一些胞外信号配体的刺激后被激活,其活化形式进入核内,发挥其转录调控的功能。某些分子包括细胞因子、激素、生长因子等均可以激活STAT信号通路[4]。STAT家族中的STAT3的活化与很多恶性增殖性疾病的发病存在着密切的联系。STAT3发生磷酸化后形成二聚体,进入细胞核,识别并结合到靶基因的DNA特异性反应元件上,并且使其下游的基因转录增强,上调某些基因的表达[5]。Sano等[2]通过免疫组化发现在银屑病患者的皮损处和邻近皮损处的正常组织中存在大量的处于磷酸化状态的STAT3表达,而正常人或其他某些非银屑病的皮肤病患者皮损处STAT3仅见少量非磷酸化的表达,以上提示STAT3信号通路的激活与银屑病的产生、持续和发展有着密切的关联。

白细胞介素(interleukin)22是一种具有免疫调节作用的炎症性因子,主要由活化的T辅助细胞中的Th22细胞、Th17细胞以及活化NK细胞分泌产生。IL-22属于IL-10家族成员,目前被认为在很多与自身免疫相关的炎症反应以及宿主的免疫防御中发挥着重要作用[6]。角质形成细胞是IL-22重要的靶细胞之一,其能够调节角质形成细胞的增殖和分化,因此,IL-22参与了很多皮肤的炎症和免疫性疾病的产生和发展,其中银屑病患者的皮损和外周血中可以发现IL-22的表达较对照正常人明显增高,而且血中的IL-22水平与银屑病的严重程度密切相关,而且皮损处的IL-22 mRNA也存在异常表达升高[7]。以上研究结果表明拮抗IL-22的生物学效应可能是银屑病潜在的治疗靶点之一。

姜黄素是一种由姜黄属草本的根茎提取的多酚类物质,目前认为姜黄素对很多由于细胞恶性增殖引起的疾病具有很好的治疗前景[8],同时具有很强的抗炎、抗氧化的功能。姜黄素发挥其生物学功效很大程度上是因为其能够调控某些转录因子的活化[9],其中有报道[10]姜黄素对一些恶性肿瘤细胞的STAT3的激活具有明显的抑制作用,从而抑制了细胞的恶性增殖,促进了其凋亡。但姜黄素能否抑制某些细胞因子引起的角质形成细胞中STAT3的活化作用,目前尚未见明确的报道。本研究以HaCaT细胞作为研究对象,拟明确姜黄素是否对IL-22诱导下STAT3的磷酸化具有干预作用。

根据本实验的研究结果,有以下发现:①经IL-22(20 ng/ml)体外培养的刺激后,HaCaT细胞中p-STAT3(Tyr705位点)表达随着时间延长,明显增强,并在30 min时达到最高峰。②加入IL-22前用姜黄素(2.5,5,10 μmol/L)预处理1 h,明显下调IL-22诱导的HaCaT的p-STAT3的表达,而且这种抑制作用具有剂量依赖性的特点。以上为姜黄素治疗银屑病等角质形成细胞异常增殖性疾病提供了理论依据。