余珊珊,孙 蕾,王 华,姜 珏,李 昊,周 琦*

(1西安交通大学第二附属医院超声科,西安 710004;2西安交通大学第一附属医院重症医学科;*通讯作者,E-mail:13909232905@163.com)

肝硬化是由多种因素长期反复作用导致肝组织发生坏死、炎症乃至纤维化,残存肝细胞结节性再生的弥漫性肝脏损伤的一类疾病。有研究[1,2]表明,肝硬化可损伤心脏的收缩、舒张功能,严重者可引起心衰,心肌重构可能是肝硬化心脏功能出现衰退的原因,但是肝硬化患者心肌组织、细胞如何重构,这些病理改变如何影响心脏功能尚不明确。本课题组前期的研究表明,应用超声心动图能够检测肝硬化患者左心室舒张功能的改变,并评估其收缩功能,在评价肝硬化患者心脏血流动力学改变中具有重要意义[3-6]。由于心肌组织活检创伤大,且肝硬化患者普遍存在凝血功能障碍[7],通常难以获得肝硬化患者心肌组织病理学结果,故本研究采用肝硬化大鼠模型,并研究肝硬化大鼠心肌组织病理学改变及应用高频超声评估其心脏功能,以期进一步了解肝硬化对心肌带来的改变及其与心功能改变的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物、模型建立及分组

雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,6-7周龄,体质量(180±20)g,由西安交通大学医学部实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(陕)2017-003。适应性饲养1周后,随机分为对照组(control,CON,n=10),肝硬化4周组(cirrhotic cardiomyopathy,CCM4,n=10)和肝硬化8周组(cirrhotic cardiomyopathy,CCM8,n=10)。所有实验动物及操作均通过西安交通大学医学院实验动物伦理委员会批准(PlublicationNo.85-23,1985)。

对照组大鼠正常饮水及摄取普通颗粒饲料。将995 ml/L的CCl4分析纯与大豆油配成400 ml/L、600 ml/L的CCl4油溶液，皮下注射部位选择大鼠颈后皮下。肝硬化4周组第1-2周腹腔注射40% CCl4油溶液，2次/周(每周一、四)，首剂量0.5 ml/100 g，余0.3 ml/100 g，10%酒精溶液作为唯一饮用水；第3-4周皮下注射60% CCl4油溶液，2次/周(每周一、四)，剂量：0.3 ml/100 g，20%酒精溶液作为唯一饮用水。肝硬化8周组第1-2周腹腔注射40% CCl4油溶液，2次/周(每周一、四),首剂量0.5 ml/100 g，余0.3 ml/100 g。10%酒精溶液作为唯一饮用水；第3-8周皮下注射60% CCl4油溶液，2次/周(每周一、四)，剂量：0.3 ml/100 g，20%酒精溶液作为唯一饮用水。整个过程中观察大鼠一般情况如毛色、活动情况、有无死亡等，最后再次称重。

1.2 大鼠高频超声心动图检测

肝硬化8周组及对照组大鼠均于造模第8周后进行心功能超声检测,各组大鼠心脏超声检查前均称量体质量,戊巴比妥(3 ml/kg)腹腔麻醉,仰卧位固定、胸部剃毛备皮。采用日立彩色超声诊断仪进行检测,EUP-L74线阵探头,探头频率5-13 MHz。取胸骨旁左室长轴和短轴切面,由二维超声引导M型曲线并进行测量。测量指标包括:左室后壁厚度(left ventricular posterior wall,LVPW)、室间隔厚度(interventricular septal,IVS)、左室舒张末期前后径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室收缩末期前后径(left ventricular end-systolic dia-meter,LVESD)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左房前后径(left atrium diameter,LAD)、二尖瓣血流频谱E峰及A峰的峰值流速比值(VE/VA)、E峰减速时间(DT)和心输出量(cardiac output,CO)等。各指标均在连续3个心动周期上测量后取其平均值。

1.3 血清及组织标本采集

肝硬化4周组于第4周后,肝硬化8周组及对照组大鼠均于第8周后心功能超声检测完毕后,处死大鼠,打开腹腔,腹主动脉取血约5 ml,3 000 r/min离心15 min,收集血清,分装后-80 ℃冻存备用,取血清约500 μl自然解冻后采用全自动生化分析仪由西安交通大学第二附属医院检验科测定乳酸脱氢酶(LDH),肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白T(cTnT);以及肝功能,包括血清丙氨酸转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清总胆红素(TBIL)、血尿素氮(BUN)、血清肌酸酐(Cr)、凝血酶原时间活动度(PTA)。打开大鼠胸腔,取大鼠肝脏和心脏,生理盐水冲洗血液,清洁滤纸吸干表面水分,分别称重肝脏和心脏湿重,先行大体肉眼观察,然后取肝脏右叶相同部位肝组织和心尖相同部位心肌组织,4%多聚甲醛(用于HE染色)中浸泡固定制备石蜡切片。

1.4 心肌及肝脏组织HE染色

石蜡切片脱蜡后,苏木素-伊红染色,脱水,中性树胶封片后在光学显微镜下观察肝脏及心肌组织病理改变。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠一般情况

对照组大鼠毛色白而有光泽,触之手感顺滑,饮食、活动皆正常;模型组大鼠毛色晦暗,粗糙,不顺滑,毛发脱落,眼睛无神,活动少。模型组大鼠厌酒精,饮用少,部分大鼠拒饮。对照组腹部皮下注射等量的生理盐水,给予普通饲料和自来水。对照组无死亡,肝硬化4周组无死亡,肝硬化8周组死亡2只。与对照组体质量线性增长相比,肝硬化8周组大鼠体质量先下降后缓慢增加,但肝硬化8周组大鼠体质量增加缓慢,后保持平稳(见图1)。

2.2 大鼠肝脏肉眼观察结果

大体观察:正常组肝脏颜色红润,表面光滑,质地均匀柔软;肝硬化4周组肝脏表面结节较小,体积较肝硬化模型组增大,质地基本均匀,无黄色颗粒;肝硬化8周组肝脏外观棕黄色,肝叶萎缩变形,体积减小,质地变硬、质量减轻,表面粗糙不光整,弥漫分布大小不均一的增生结节,部分可见黄色颗粒分布,与正常肝脏形成鲜明对比。

图1 肝硬化8周组和对照组大鼠体质量变化情况Figure 1 Changes of body weight in cirrhosis 8 week group and control group

2.3 大鼠血清生化学指标

与对照组比较,肝硬化4周和8周组TBIL、BUN、Cr、ALB、PTA、ALT差异均有统计学意义(P<0.05)。肝硬化4周和8周组ALB、PTA较对照组减低(P<0.05)，而TBIL、ALT、BUN、Cr较对照组升高(P<0.05,见表1)。肝硬化8周组与4周组相比，TBIL、ALT、ALB、Cr、BUN、PTA差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。

2.4 肝硬化组和对照组肝脏病理学

对照组肝小叶结构正常,中央静脉周围肝细胞呈放射状排列,无明显炎性细胞浸润。肝硬化4周组出现结缔组织,肝小叶结构出现异常。肝硬化8周组正常肝小叶结构消失或破坏而被假小叶所取代;部分假小叶由数个不完整的肝小叶构成,中央静脉偏向边缘,甚至没有中央静脉;有的假小叶则由再生肝细胞结节构成,肝细胞的排列和血窦的分布极不规则;假小叶内肝细胞有不同程度的脂肪变性、炎性细胞浸润,汇管区因结缔组织增生而显著增宽(见图2),与正常肝脏形成鲜明的对比。

表1 对照组和肝硬化组大鼠血清学指标变化Table 1 Changes of serological indicators in normal and cirrhotic rats

与对照组相比,*P<0.05;与肝硬化4周组比较，#P<0.05

A.对照组 B.肝硬化4周组 C.肝硬化8周组图2 对照组与肝硬化组大鼠肝脏组织HE染色 (×100)Figure 2 HE staining of rat liver in normal control group and cirrhosis groups (×100)

2.5 心肌病理学

对照组心肌纤维排列整齐,结构清晰,细胞核呈圆形或椭圆形,居于细胞中央,心肌间质及微血管等结构正常;肝硬化4周组心肌纤维走向基本整齐,心肌出现空泡化以及间质增生;肝硬化8周组可见心肌细胞肿胀、松散,排列紊乱,结构不清晰,间质内血管扩张充血,血管周围见炎性细胞浸润,细胞外间质增多(见图3)。

图3 对照组与肝硬化组大鼠心肌组织HE染色Figure 3 HE staining of myocardium in normal control group and cirrhosis groups

2.6 对照组和肝硬化组常规超声结果

与对照组比较,肝硬化8周组患者LVESD、LVEDD、IVS、LAD明显增大,差异均具有统计学意义(P<0.05);肝硬化8周组心输出量增加、VE/VA比值降低、DT延长,差异均具有统计学意义(P<0.05);LVPWT和LVEF无明显变化,差异无统计学意义(见表2、图4)。

表2 对照组和肝硬化组常规超声结果Table 2 Comparison of ultrasound results between control group and cirrhosis group

与对照组相比,*P<0.05

A.对照组 B.肝硬化8周组图4 肝硬化大鼠超声心功能检测Figure 4 Echocardiographic results in cirrhotic rats

2.7 血清心肌酶及肌钙蛋白的变化

与对照组相比,肝硬化4周和8周组大鼠心肌LDH、CK-MB、cTnT均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。肝硬化8周组与4周组相比，LDH、CK-MB、cTnT差异均有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 各组大鼠心肌酶及肌钙蛋白比较Table 3 Comparison of myocardial enzymes and cTnT between three groups

与对照组相比,*P<0.05;与肝硬化4周组比较，#P<0.05

3 讨论

肝硬化在我国发病率高,是严重威胁我国居民健康的常见病、多发病,现有的治疗效果并不理想,故建立适宜的肝硬化动物模型对于评价疗效具有不可忽视的作用。前期的临床研究证实,肝硬化患者可出现心脏收缩、舒张功能受损[3-6],心肌重构可能是肝硬化心脏功能出现衰退的原因,但是其心肌组织和细胞如何重构,这些病理改变如何影响心脏功能尚不明确。本研究采用大鼠进行肝硬化造模,在成功造模的基础上,对大鼠心肌病理、心脏功能、心肌酶及肌钙蛋白等进行了检测,有效地模拟了心肌损害,为临床评价肝硬化心肌损害提供了有效的依据。

本研究使用四氯化碳+乙醇复合法对大鼠进行肝硬化造模,实验组大鼠40%-60%四氯化碳皮下注射联合20%乙醇作为大鼠唯一饮水源,4周时即可出现肝结缔组织增生,8周左右正常肝小叶结构消失、破坏而被假小叶取代,部分假小叶由数个不完整的肝小叶构成,中央静脉偏向边缘,甚至没有中央静脉,有的假小叶由再生肝细胞结节构成,肝细胞排列和血窦分布均极不规则;假小叶内的肝细胞有不同程度脂肪变性和炎性细胞浸润,汇管区因结缔组织增生显著增宽,与正常肝脏组织形成鲜明对比,即可形成典型的肝硬化模型。与翟伟等[8]报道结果相一致,8周末肝细胞变性坏死、贮脂细胞开始活化。该方法可加速肝脏纤维化过程,缩短造模时间。本实验同时检测了对照组以及肝硬化4周和8周组血清生化学相关指标的变化,结果显示对照组、肝硬化4周和8周组TBIL、BUN、Cr、ALT、ALB、PTA等指标差异均有统计学意义，肝硬化4周和8周组ALB、PTA均较对照组减低(P<0.01)，而TBIL、ALT、BUN、Cr较对照组升高(P<0.01),肝硬化8周组与肝硬化4周组相比，TBIL、ALT、ALB、Cr、BUN、PTA差异均有统计学意义(P<0.05)，这进一步提示应用本实验的肝硬化模型造模成功。大鼠肝脏组织病理学结果及血清生化指标均提示,随着给药时间的延长,肝硬化程度更加明显,这与肝硬化的发生发展病理过程相一致。

本研究检测了肝硬化模型组与对照组心肌病理学变化,其中对照组心肌纤维排列整齐、结构清晰、细胞核呈圆形或椭圆形,居于细胞的中央,心肌间质和微血管等结构正常;肝硬化4周组心肌组织开始出现变化,呈中间过渡状态,心肌纤维走向基本整齐,心肌出现空泡化以及间质增生;肝硬化8周组可见心肌细胞肿胀松散、排列紊乱、结构不清晰、间质内血管扩张充血、血管周围炎性细胞浸润、细胞外间质增多。这表明肝硬化大鼠8周后出现了明确的心肌损害,肝硬化大鼠心肌细胞及间质均存在明显结构改变:心肌细胞肿胀,间质细胞增多。这说明肝硬化大鼠不仅发生了心肌细胞肥大,还可出现心肌间质增生,即心肌间质亦发生了重构。这一改变可能是心脏收缩、舒张功能减低的病理学基础,心肌间质重构包括心脏成纤维细胞增生、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)质和量异常,以及微血管结构的改变。分布于心脏细胞外基质中的胶原主要有Ⅰ、Ⅲ、ⅡⅤ和Ⅴ等型,其中Ⅰ型胶原占胶原总量的2/3以上[9],是心肌ECM的最主要组成成分,其硬度大,回弹伸展性小,抗牵拉性强,能够保持心室壁的强度和硬度。少量Ⅰ型胶原的增加,即可增加心肌僵硬度,从而影响心脏的收缩和舒张功能。心肌间质胶原的独特结构对心脏收缩及舒张功能有着重要的作用,而Ⅰ型胶原作为基质主要构成成分,其数量及适当的比值对维持心肌组织结构及心脏功能的完整性具有非常重要的意义[10]。本研究中大鼠心肌组织中细胞外间质明显增多,从病理学角度解释了前期实验肝硬化患者心脏功能减低的可能机制,由于条件限制,本实验并没有能够对大鼠心肌细胞外间质成分进行进一步分型研究,期待今后的研究工作能够对增生的心肌间质成分进行分型,进一步阐明心肌病理学改变与心功能减低的关系。

生物化学标志物如心肌酶和心肌蛋白是反应心肌损伤的指标之一,前者有天门冬氨酸氨基转移酶(AST),乳酸脱氢酶(LD)、肌酸激酶(CK)及其同工酶,后者有肌钙蛋白。心肌在缺氧缺血、甚至坏死时,心肌细胞膜通透性可能发生变化,存在于心肌内的心肌标记物易于释放,从而引起心肌酶学相关标志物的改变。本研究检测了对照组与肝硬化4周和8周组心肌损伤相关标志物,与对照组相比较,肝硬化4周和8周组大鼠心肌LDH、CK-MB以及肌钙蛋白显著升高(P<0.05);肝硬化8周组与4周组相比，LDH、CK-MB、cTnT差异均有统计学意义(P<0.05)，这提示应用本研究方法,肝硬化造模8周后出现了明显的心肌损害,这从心肌酶学角度提示了肝硬化心肌损害模型的成功。

本实验还检测了肝硬化8周组常规超声相关指标的变化。其中肝硬化8周组与对照组比较,LVESD、LVEDD、IVST、LAD明显增大,差异均具有统计学意义(P<0.05);肝硬化模型8周组心输出量增加、VE/VA比值降低、DT延长,差异均具有统计学意义(P<0.05);这与临床肝硬化患者超声诊断的结果相一致,提示该造模方法在一定程度上可以模拟肝硬化患者心肌损害从而导致心功能的变化。高频超声能够清晰地检测大鼠心脏功能的各项指标,肝硬化大鼠心脏血流动力学指标较对照组有所减低,为研究肝硬化心肌病发病机制提供了一种有效的模型和检验方法。

综上所述,肝硬化是我国的常见病和多发病,也是一种死亡率较高的全球性疾病。许多研究证实[11,12],肝硬化早期时心脏功能呈代偿性改变,即心输出量、心率、血浆容量增加,动脉压下降,外周阻力下降,CCM作为肝硬化患者的重要并发症之一,其临床症状隐匿,未受到人们重视,对肝硬化患者心脏损害的早期诊断和治疗已经成为临床治疗肝硬化一个重要部分[13]。本研究通过动物实验证实了肝硬化大鼠心肌细胞损害及高频超声检测发现其对应的出现心功能的减低,为进一步研究其发病机制奠定了一定基础。