乔 晶,薛静静,王 彦

(1山西医科大学第一临床医学院内分泌科,太原 030001;2山西医科大学第一医院重症医学科;3山西医科大学第一医院内分泌科;*通讯作者,E-mail:wyroad@126.com)

我国是糖尿病的重灾区,成人糖尿病患者人数居全球第一[1]。糖尿病具有较高的致残率和致死率,且常与高血压病伴随出现[2,3]。众所周知,糖尿病患者肝脏、肌肉、脂肪组织等靶器官存在胰岛素抵抗(IR)。Xu等[4]研究证实,高脂诱导的肥胖大鼠的胰岛细胞也存在IR,而胰岛素受体信号转导障碍是其发生IR的重要机制之一。蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)是胰岛素信号转导过程中的关键分子,负调控胰岛素信号通路,成为糖尿病治疗的新靶点[5]。替米沙坦是血管紧张素Ⅱ受体阻断剂类降压药物,可改善IR,保护胰岛功能[6]。那么替米沙坦是否可通过影响胰岛PTP-1B表达来增强胰岛素的信号转导,保护胰岛功能?目前尚缺乏相关报道。本研究通过观察替米沙坦对长期高糖高脂膳食诱导的IR大鼠胰岛PTP-1B表达的影响,探讨替米沙坦保护胰岛功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级6-8周龄雄性SD大鼠40只,体质量180-200 g,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.2 主要试剂与仪器

替米沙坦片购自江苏万邦生化医药集团有限责任公司,胰岛素ELISA试剂盒购自上海将来实业股份有限公司,免疫组化染色孵育盒购自福州迈新生物技术开发有限公司,兔抗鼠PTP-1B多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,山羊抗兔/鼠IgG抗体pv6000购自北京中杉金桥生物技术有限公司。血糖仪购自美国强生公司,全自动生化分析仪购自深圳迈瑞公司。

1.3 高糖高脂大鼠模型的建立

40只大鼠适应性喂养1周,随机分为4组(n=10)。对照组给予普通饲料喂养,高糖高脂组(HSHF组)、替米沙坦5 mg组(T5 mg组)和替米沙坦10 mg组(T10 mg组)均给予高糖高脂饲料(70%正常饲料,20%猪油,10%蔗糖,1%胆固醇,0.25%胆酸)喂养,两种饲料由山西医科大学动物中心提供。大鼠分笼喂养,环境温度为22-26 ℃,湿度为55%-60%,每日光照时间为12 h,自由摄食及进水。

1.4 干预方法

对照组普通饲料喂养,其余组高糖高脂饲料喂养,第24周末,NC组继续饲予普通饲料并灌胃给予2 ml生理盐水,HSHF组继续饲予HSHF饲料并灌胃给予2 ml生理盐水,T5 mg组和T10 mg组继续饲予HSHF饲料并分别灌胃给予溶于2 ml生理盐水的替米沙坦5 mg/(kg·d)和10 mg/(kg·d),以上处理均持续12周,灌胃1次/d。

1.5 空腹血糖、甘油三酯、胰岛素的测定

随机取各组大鼠6只,大鼠禁食15 h,称体质量,乌拉坦4 ml/kg腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,全部血标本经3 000 r/min,离心10 min,取分离后的血浆,血糖仪测定空腹血浆葡萄糖糖(FPG),将分离后的血清分装于无菌EP管内,全自动生化分析仪测定甘油三酯(TG),ELISA试剂盒测定空腹胰岛素(FINS),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。

1.6 检测大鼠胰岛PTP-1B蛋白的表达

第36周末，处死大鼠取胰腺组织置于10%中性甲醛溶液固定，用石蜡包埋，2 μm厚度切片，56 ℃烤箱过夜，常规脱蜡、水化，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性15 min，蒸馏水洗5 min，PBS洗2 min×3次，放入枸橼酸缓冲液高压锅中加热至沸腾，进行抗原修复2 min，冷却后，PBS洗2 min×3次，加入一抗(浓度1 ∶100的PTP-1B抗体)，37 ℃温箱孵育1 h，PBS洗2 min×3次，加入二抗(山羊抗兔/鼠IgG抗体)，37 ℃温箱孵育20 min，PBS洗2 min×3次，DAB显色，苏木精复染2 min、脱水、透明封片，显微镜下观察，阳性反应是细胞质染成棕色，采用美国aperio公司scanscope数字病理扫描系统扫描并用半定量对阳性着色单位面积灰度进行分析，每个切片，盲法取6个视野，光密度值OD=log(240/灰度)为量化指标。

1.7 统计学分析

全部数据经SPSS 23.0软件进行统计分析。结果用均数±标准差表示。多组间数据比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠FPG、FINS、TG、HOMA-IR的比较

与对照组比较,HSHF组的FPG、FINS、TG水平及HOMA-IR均明显升高(P<0.05)。与HSHF组比较,T5 mg组和T10 mg组的FPG、FINS、TG水平及HOMA-IR均显著低于HSHF组(P<0.05,见表1),且T5 mg组和T10 mg组各指标差异均有统计学意义。

表1 大鼠FPG、FINS、TG、HOMA-IR的比较 (n=6)Table 1 Comparison of FPG, FINS, TG, HOMA-IR in rats among four groups (n=6)

与NC组比较,*P<0.05;与HSHF组比较,#P<0.05;与T5 mg组比较,&P<0.05

2.2 大鼠胰岛PTP-1B表达的比较

阳性颗粒呈棕黄色,定位于胞浆(见图1)。第36周末,PTP-1B OD值NC组为0.07±0.002,HSHF组为0.10±0.006,T5 mg组为0.10±0.002,T5 mg组为0.09±0.002。与NC组相比,HSHF组PTP-1B表达升高,差异有统计学意义(P<0.001)。与HSHF组相比,T5 mg组PTP-1B表达降低,差异有统计学意义(P=0.001),T10 mg组PTP-1B表达降低,差异有统计学意义(P<0.001)。与T5 mg组相比,T10 mg组PTP-1B表达降低,差异有统计学意义(P=0.002)。

图1 大鼠免疫组化胰岛PTP-1B蛋白表达 (×400)Figure 1 Expression of PTP-1B protein in islet of rats in each group (×400)

3 讨论

蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一员,它是多受体酪氨酸激酶(RTKs)的负调节因子,与多种信号通路相关联[7]。近年研究证实,胰岛细胞也存在胰岛素抵抗(IR),胰岛素信号是通过胰岛素受体及其下游靶点的酪氨酸磷酸化来介导的[8-10]。蛋白酪氨酸磷酸酶可通过去磷酸化激活胰岛素受体复合物中的特异性酪氨酸残基以抑制胰岛素信号转导[11]。张丽娟等[12]通过研究高脂膳食诱导的肥胖大鼠胰腺中PTP-1B的表达,观察到肥胖组的FINS、TG和HOMA-IR明显高于对照组,胰腺中PTP-1B表达水平增加,胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化程度减弱,胰岛素信号转导通路被抑制,提示PTP-1B是大鼠发生胰岛细胞IR的主要调控因子。吴鸿等[13]研究证实当胰岛β细胞内PTP-1B过表达时,可降低胰岛素受体IRβ和胰岛素底物IRS-1的磷酸化,使胰岛素信号转导发生障碍,胰岛细胞出现IR。Cicirelli等[14]给非洲爪蟾卵母细胞注射微量PTP-1B,可抑制胰岛素刺激的酪氨酸磷酸化过程。

血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARBs)能够降低新发糖尿病患病率[15],但其改善糖代谢的机制尚未完全阐明。闫文华等[16]探讨了ARB类降压药物坎地沙坦对高脂诱导胰岛素抵抗大鼠的脂肪组织中PTP-1B的影响,与高脂组大鼠相比,坎地沙坦组大鼠脂肪组织中PTP-1B的mRNA和蛋白表达含量显著降低,推测坎地沙坦可能通过减少脂肪组织中PTP-1B基因和蛋白的表达改善了胰岛素的敏感性。其他ARB类降压药物对胰岛PTP-1B的影响目前尚未报道,此途径是否为ARB类药物的类效应?

替米沙坦也是ARB类降压药物,研究证实其可通过减少胰岛细胞脂肪堆积、抗炎、抗氧化应激和内质网应激等改善胰岛细胞的胰岛素抵抗[17],但其对胰岛PTP-1B表达影响的相关报道罕见。本研究中,高糖高脂膳食诱导的IR大鼠经替米沙坦干预后,TG、FPG、FINS水平和HOMA-IR均显著降低(P<0.05),且T10 mg组大鼠的TG、FPG、FINS水平和HOMA-IR下降程度比T5 mg组大鼠的下降程度更显著(P<0.05),提示替米沙坦能够改善高糖高脂喂养大鼠的IR,且呈剂量依赖性。与正常对照组比较,高糖高脂组大鼠胰岛PTP-1B表达显著升高(P<0.05),T5 mg组和T10 mg组胰岛PTP-1B表达显著降低(P<0.05),提示替米沙坦可能是通过下调胰岛PTP-1B的表达改善了IR大鼠的胰岛功能,从而改善了糖代谢。

如前所述,替米沙坦可抑制胰岛PTP-1B的表达,这可能是其改善胰岛素抵抗、保护胰岛功能的机制之一。目前关于替米沙坦影响PTP-1B的具体机制的报道少见,Akasaki等[18]研究证实过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂曲格列酮能通过PPAR-γ依赖性途径影响PTP-1B蛋白的表达活性,而替米沙坦同样作为一种选择性PPAR-γ激动剂,可影响参与糖脂质代谢,进而改善胰岛素抵抗[19]。那么,替米沙坦是否会通过PPAR-γ介导的途径来影响PTP-1B蛋白的活性,仍待进一步深入研究。