王 群，曾晓玲，余 蕾，赵淑云

（1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院产科，贵州 贵阳 550004；3.贵州医科大学附属医院产前诊断中心，贵州 贵阳 550004；4.贵州医科大学附属医院生殖中心，贵州 贵阳 550004）

目前出生缺陷逐渐成为婴儿死亡的主要原因以及导致儿童残疾的重要原因。2012年在《中国出生缺陷防治报告》中统计显示：我国是出生缺陷的高发国家，我国出生缺陷的发生率约为5.6%，每年约有25万例在出生时有明显临床可见出生缺陷。临床常见染色体异常遗传疾病有唐氏综合征(21-三体)、爱德华综合征(18-三体)、Patau综合征(13-三体)、Turner综合征(45,X)、Klinefelter综合征(47,XXY)，在产前诊断疾病中约占80%。2013年在《全国妇幼卫生信息分析报告》中显示：先天性心脏病、多指（趾）、总唇裂、先天性脑积水以及马蹄内翻在2012年出生缺陷患儿中位居前5位。很多染色体微缺失、微重复异常可导致新生儿出现上述缺陷。据相关研究统计，不明原因的智力低下、多发畸形及发育迟缓中约有12%是由染色体微缺失/微重复所致。目前则主要通过实施产前检测技术对出生缺陷进行筛查，并采取相应干预措施以降低出生缺陷的发生率。

1 产前检测技术的发展

产前筛查常用方法有：血清学筛查（二联法检出率为71%，假阳性率为5%；三联法检出率71%，假阳性率5%；四联法检出率83%，假阳性率8%[1]）、产前超声测定胎儿颈项透明层 (NT)厚度、系统超声等。对于孕母血清学筛查高风险患者则需进一步行侵入性产前诊断（羊水穿刺、脐血穿刺、胎儿镜）。目前最为广泛应用的的血清学筛查技术因其较低的检出率导致出生缺陷发生率增加，侵入性手段会导致流产（绒毛穿刺：1%～3%。羊膜腔穿刺：0.2%～0.5%、脐静脉穿刺：1%～2%）、宫内感染等不良妊娠结局[2]，且绒毛取样还存在不能回避限制性胎盘嵌合问题的弊端[3]。两者均在经济及精神方面为社会及家庭带来沉重负担，且较高的假阳性率增加了不必要的侵入性产前诊断，增加了正常胎儿丢失的风险，降低了产前诊断的依从性[4]。因此，人们希望一种快速、准确且无创的产前检测方法的诞生。

随着分子生物学检测技术的迅速发展，在1997年有学者在孕妇外周血中检测到胎儿游离DNA(cell-free fetalDNA,cffDNA)并且应用于检测胎儿性别以筛查与性别相关疾病的胎儿。cffDNA几乎全部来源于胎盘滋养层细胞，最早可在妊娠第4周的母体外周血中被检测出来，在妊娠7周胎儿胎盘循环建立后，cffDNA即在母体外周血中以一定的比例稳定存在，且可达到检测的浓度要求[5]。在孕10周后可在几乎所有的孕妇外周血中检测出[3]。cffDNA在母体血浆游离DNA总量中仅占5%～30%,其随孕周的增大而增多。cffDNA片段大小为75～250bp，分娩后母体外周血中cffDNA可快速降解，故多孕次孕妇的产前诊断结果不受前一次妊娠时cffDNA的干扰[4]。此种方法是通过抽取孕妇外周血进行检测，是一种无创的产前检测方法。

随着高通量测序技术（ next generation sequencing,NGS）的发明与发展，孕妇外周血行胎儿非整倍体评估的NIPT技术使产前筛查步入更为广阔的发展空间。NIPT主要的检测范围为胎儿的21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征，与传统的血清学筛查相比较而言有着更高的准确性及更低的假阳性率。且已在临床应用中取得显著成效。在2012年美国妇产科医师学会(the American college of obstetricians and gynecologists,ACOG)及美国母胎医学学会(the Society for maternal-fetal medicine,SMFM)均推荐NIPT作为非整倍体高危人群的一种初筛检测。因NIPT具有高敏感性、高特异性、低假阳性率及无创性等优点使其在国内外广泛应用于临床。

2 NIPT在胎儿染色体微缺失微重复检测的研究进展

随着高通量测序深度的提高，NIPT技术得到了进一步的拓展，且国内外学者对其进行了大量的临床研究。2011年新英格兰医学杂志中有学者报道了首例无创产前诊断胎儿微缺失综合征；Waper[6]等于研究中发现胎儿22q11.2缺失的检出率为97.8%，假阳性率为0.76%；1p36缺失、Cri-duchat综合征、Prader-Willi综合征及Angelman综合征的检出率均为100%，假阳性率为0%。尽管染色体微缺失/微重复综合征的发病率目前还不是非常明确，但有研究发现染色体微缺失/微重复在母体染色体正常的胎儿中发生率也可达1%～1.7%。相关临床研究表明：核型正常的情况下，6% B超显示异常和1.7%高龄或唐筛阳性的病例中存在致病性染色体拷贝数变异(copy number variation,CNV)。然而与染色体非整倍体疾病不同，致病CNV的发生风险与孕妇年龄并没有密切的关联，提示针对低龄孕妇（三大常染色体非整倍体的低风险人群）中胎儿可能出现致病CNV的风险目前是被忽视的。依托高通量测序技术，通过对孕妇外周血中胎儿游离DNA的检测，尽可能多的判断胎儿染色体疾病已成为行业风向，并在世界范围内被应用于实践。基于以上研究，各大国际机构均扩大了NIPT的筛查范围。2015年，意大利报道了第一例应用Panorama TM Plus检测出胎儿DiGeorge综合征。赵永和[7]等发现：NIPT检测结果显示13号、18号染色体微缺失病例各一例，18号染色体微重复病例经染色体微阵列分析(Chromosomal Microarray Analysis CMA)证实为阳性结果。但近年，有相关学者研究发现了NIPT在筛查微缺失微重复层面存在的假阴性/阳性病例。池一婵[8]等人的研究中发现一例NIPT提示CHr18长臂末端存在缺失及重复，而微阵列比较基因组杂交（array based comparative genomic hybridization，Array-CGH）检测结果显示缺失而未见重复，胎儿引产后取脐静脉血行基因检测结果显示缺失，未见重复，死胎外观双手重叠指、耳位底、贯通掌，尸检见肝大、多囊肾等异常。此项研究中还显示NIPT检测假阳性病例4例（7号染色体偏多），经Array-CGH检测及超声随访均未见异常，产后新生儿表型正常；假阴性病例1例，因超声提示胫骨发育异常行NIPT提示未见异常，继而行Array-CGH检测及核型分析，核型分析结果未见异常，Array-CGH检测结果提示10q11.22区段微重复，而此区段微重复可导致骨骼发育异常。周静[9]等人报道1例NIPT阴性的病例，在新生儿出生后表现为颈后皮肤后缀、鼻梁低平，经核型分析及Array-CGH检测均证实为4号染色体短臂缺失，为WOLF综合征； 胡芷阳[10]等人的研究中证实1例假阳性病例，该病例母亲血测序发现有微重复情况。有研究发现：NIPT可检测300kb以上胎儿基因组微缺失/微重复，然而对于小于300kb的片段则可出现假阴性或假阳性[11]。目前普遍采用的NIPT计算模式假设所有母亲全部片段的DNA拷贝数是一致的，因此如果母体有缺失或重复时，就可能造成NIPT结果的假阳性或假阴性。故对于NIPT筛查出的微缺失/微重复必须行进一步产前诊断来明确诊断，以排除假阴性/假阳性导致的胎儿不良结局。柯玮琳[12]等应用Array-CGH证实染色体核型分析对CNV总的漏诊率为46.2%。较高的漏诊率表明染色体核型分析在CNV层面上具有明显的局限性。染色体核型分析技术虽为最经典和常见的诊断方法，但分辨率较低，一般只能检测出10Mb以上的重复、缺失、易位等结构异常，几乎所有＜5MB染色体不平衡畸变不能被染色体核型分析识别。Array-CGH为诊断CNV提供了高分辨率全基因组筛选，并且可以被用于检测未知基因组DNA片段的增减，但Array-CGH 不能检测出平衡易位、倒位等不存在染色缺失、重复的结构异常，也不能检测出多倍体及低比例嵌合[13]， 故NIPT筛查出的微缺失/微重复病例可进一步行染色体核型分析及Array-CGH检测明确诊断，两者结合可降低CNV的漏诊率。

有公司推出覆盖常见的三大染色体、性染色体及高发微缺失微重复综合征的无创检测项目。微缺失/微重复综合征主要包括以下7种：22q11.2 deletion 综合征（含Digeorge综合征）、1p36 deletion 综合征、2q33.1 deletion 综合征、Cri-Du-Chat综合征、Langer-Giedion综合征、Angelman综合征、Prader-Willi 综合征。截止2016年6月在DECIPHER数据库中收录关于有明确CNV注释的疾病，其中有命名的染色体微缺失/微重复综合征达70余种，病例达50000多例。但国际产前诊断学会（international society for prenatal diagnosis,ISPD）表示NIPT扩展检测应当局限于在研究清楚的微缺失/微重复综合征范围内，且需要结合临床。因NIPT存在假阳性、假阴性结果，NIPT检测出的染色体微缺失/微重复病例应结合B超随访结果、染色体核型分析及染色体微阵列分析/Array-CGH检测结果综合分析后决定胎儿的存留，而对于阴性结果则应超声随访，必要时行产前诊断明确是否存在CNV。因CNV存在基因多态性，且并非所有检测出的微缺失/微重复均可致病，故应慎重向家属解释染色体微缺失/微重复结果，且现仍缺少大规模的前瞻性临床检测数据，应慎重应用于常规产前筛查。