孙科，叶亮，刘细平，徐绍忠，李志东，祁江

0 引言

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，主要治疗方法包括手术、放疗和化疗等，但总体疗效不满意，有必要探索新的治疗策略。免疫治疗旨在重新激活免疫系统，以消除癌细胞，是目前新的治疗方案。有文献报道多种恶性肿瘤细胞表面携带有促吞噬作用的钙网蛋白（Calreticulin,CRT），其可发送信号招募巨噬细胞吞噬并消化癌细胞[1]；恶性肿瘤细胞还表达另外一种分子CD47，产生抑制性作用，能抵消CRT信号。本研究通过检测胃癌组织中CRT和CD47的表达，分析两者的表达与临床病理参数的关系，探讨两者在胃癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2013年6月—2015年5月在株洲市中心医院普外一科行胃癌根治术的患者病理标本50例，术前未接受放化疗，所有资料均经病理证实为胃癌；同时选取相对应癌旁正常组织（安全界外1 cm）病理标本作为对照。本组50例中，男28例、女22例，年龄45～81岁，平均年龄（60.5±14.2）岁。胃窦癌36例、胃体癌14例，均是胃腺癌。其中高分化14例、中分化16例、低分化20例。根据美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer, AJCC）公布的胃癌TNM分期，T1期3例，T2期12例，T3期19例，T4期16例。术后随访36～57月。

1.2 检测CRT、CD47蛋白的表达水平

胃癌及癌旁组织石蜡包埋标本，均由我院两位高年资病理医师对标本观察，确认并圈出组织芯的代表区域，对标记部位蜡块上取材、打孔，孔径为2 mm，将胃癌组织、癌旁组织芯放入蜡块孔内，将每个蜡块制作组织芯，50℃将蜡块融合，行4 μm厚连续切片。采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶法检测胃癌组织中CRT、CD47蛋白的表达水平，CRT及CD47单克隆抗体均是美国Abcam公司产品，根据预实验情况，配制CRT抗体浓度1：1 400、CD47抗体浓度1：300。按说明书操作，蜡块切片，脱蜡至水，将切片浸于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH6.0）中加热煮沸2.5 min修复，冷却，滴入内源性过氧化物酶阻断剂，15 min后水洗，置入磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡，分别滴入一抗（CRT、CD47抗体），滴入CD47抗体，-4℃孵育过夜，滴入CRT抗体不过夜，标本用PBS浸泡，再滴二抗（酶标羊抗鼠/兔IgG联合物，购自美国DAKO公司），放入37℃恒温箱中孵育，经DAB显色，苏木精对比染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。结果判断：由本院两位高年资病理科医师进行双盲阅片、并评分，标准如下：每张切片随机选取10个高倍视野（×400）下计数，根据阳性细胞数及染色强度划分等级。（1）阳性细胞数＜1%为0分，1%～10%为1分，＞10%～50%为2分，＞50%为3分；（2）染色强度：阴性为0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分。得分为（1）+（2），总分为0～6分，0分（-），1～2分（+），3～4分（++），5～6分（+++）。（-）～（+）是低表达，（++）～（+++）是高表达。

1.3 统计学方法

所有资料采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料（±s）表示，两样本均数比较采用t检验，计数资料率的比较用χ2检验，Kaplan-Meier生存曲线分析CRT、CD47不同表达的胃癌患者术后3年生存率，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CRT、CD47在胃癌及癌旁组织中的表达

CRT、CD47在胃癌组织及癌旁组织中均有阳性表达，CRT的阳性表达主要位于胞质中，见图1，细胞核及细胞膜中未见表达，镜下阳性细胞呈棕黄色；CD47的阳性表达主要位于细胞核、胞质，见图2，镜下阳性细胞呈深黄色。

胃癌组织中CRT、CD47高表达率分别为68.0%（34/50）、56.0%（28/50）；癌旁组织中CRT、CD47高表达率分别为26.0%（13/50）、28.0%（14/50）。CRT、CD47在胃癌组织中的高表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义（P=0.001、0.005），见表1。

2.2 CRT、CD47在胃癌组织中的表达及与临床参数关系

结果显示CRT、CD47高表达者与肿瘤分化程度、淋巴结有转移及肿瘤浸润深度有关（P＜0.05），与年龄、性别、肿瘤大小无关（P＞0.05），见表2。

2.3 CRT、CD47不同表达组胃癌患者根治术后3年生存情况

图1 CRT在胃癌组织和癌旁组织中的表达 (SP ×400)Figure1 CRT expression in gastric cancer and adjacent normal tissues (SP ×400)

图2 CD47在胃癌组织和癌旁组织中的表达 (SP ×400)Figure2 CD47 expression in gastric cancer and adjacent normal tissues (SP ×400)

表1 CRT和CD47在胃癌组织与癌旁组织中的表达Table1 Expressions of CRT and CD47 in gastric cancer and adjacent normal tissues

表2 CRT、CD47在胃癌组织中的表达及与临床病理参数关系 (例(%))Table2 Correlation between CRT, CD47 expression and clinicopathologic parameters of gastric cancer patients(n(%))

采用Kaplan-Meier绘制胃癌根治术后3年生存率曲线，显示CRT、CD47高表达组较低表达组的生存时间短，差异有统计学意义（P=0.039、0.043），见图3。

图3 不同CRT(A)、CD47(B)表达水平组胃癌根治术后3年生存率曲线Figure3 Three-year survival curves of gastric cancer patients with different expression levels of CRT(A) and CD47(B)

3 讨论

钙网蛋白（CRT）是内质网和肌浆网中主要的Ca2+结合蛋白[1]，广泛存在于哺乳动物细胞中。在肿瘤免疫监视中，细胞膜表面CRT分子增多、聚集成簇，递呈肿瘤抗原，表达一种“来吃我”的信号，招募巨噬细胞，启动吞噬、清除细胞[2]，是肿瘤免疫原性死亡的标志[3]。CD47又称整联蛋白（integrin-associated protein），是表达在细胞膜表面的免疫球蛋白样蛋白质[4]，CD47与其配体信号调节蛋白α链结合后产生抑制抗性信号[5]，下调巨噬细胞吞噬作用，对固有免疫系统产生抑制作用，使肿瘤细胞逃避巨噬细胞的吞噬，表达“别吃我”信号[6]，抵抗CRT信号。CRT和CD47参与多种肿瘤的发生和发展，在胃癌细胞的凋亡和免疫逃逸中扮演重要角色。

CRT在胃癌中的表达及与胃癌发生转移的关系尚有争议，多项研究报道胃癌中CRT呈高表达，曲晶磊等[7]报道胃癌组织中CRT阳性表达率为84.3%；王妍等[8]报道胃癌组织中CRT基因的表达量比癌旁组织上调3.70倍。肿瘤组织恶性程度越高，更多的CRT聚集，CRT蛋白表达上调，因此检验发现往往CRT高表达的胃癌细胞，侵袭力更强，且与生存期、淋巴结转移、肿瘤分期呈正相关[9-10]。本研究胃癌组织中CRT高表达率为68%，高于癌旁组织的26%（P＜0.05），CRT高表达与分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润深度正相关，显示CRT高表达与胃癌的发生发展有密切关系。

与上述研究结论不同的是，黄红丽等[11-12]报道CRT在胃腺癌细胞株中mRNA及蛋白质水平均较正常胃黏膜上皮细胞下调，胃癌组织中CRT阳性表达率明显低于正常胃组织。猜测可能的原因是CRT在胃癌免疫中仍有较多的机制不详，如CRT主要在内质网、胞质中，当细胞膜CRT蛋白聚集时才发出“来吃我”信号，CRT低表达水平是否受CRT胞内释放、膜转移、重新分布等影响，细胞膜CRT蛋白聚集对CRT基因是否有负反馈调节，这些机制有待于进一步研究。

肿瘤细胞膜表面出现大量CRT，如果伴随CD47表达量明显下降，可增强细胞被吞噬的效率[13]。而如果不伴有CD47表达下降，肿瘤细胞通过高表达CD47逃避巨噬细胞吞噬及细胞毒性作用[14]，肿瘤呈进展态势、恶性程度增高。甘波等[15]报道CD47在胃癌组织中表达率为51.85%，高于癌旁组织的36.84%（P＜0.05），CD47表达强度在低分化、有淋巴结转移、浸润更深的患者中表达更高。Sudo等[16]报道胃癌组织中CD47蛋白表达升高。Yoshida等[17]报道49.5%的胃癌细胞中CD47呈高表达；将胃癌细胞培养，发现CD47高表达的胃癌细胞持续生长的时间更长，且形成的瘤体更大，具有较强的增殖能力。本研究检测胃癌组织中CD47高表达率为56.0%，高于癌旁组织的28%（P＜0.05）。CD47高表达的胃癌分化程度低、浸润深度及淋巴结转移增加，证实CD47在胃癌组织中呈高表达，促进肿瘤的发生和发展。

CRT、CD47在胃癌细胞凋亡和免疫逃逸中扮演重要角色，机体维持两者的平衡，当不平衡时，免疫监视缺乏，导致肿瘤细胞增殖、发展。多数肿瘤细胞中CD47、CRT的表达常相伴进行，以防护CRT介导的吞噬作用[18]，因此当CD47高水平表达时，能抵抗CRT的促吞噬及免疫激活功能，从而允许虽有CRT表达的细胞不被吞噬并获得额外的突变，最后转化成恶性细胞。通过对CRT、CD47不同表达患者3年生存率曲线的分析，CRT、CD47高表达的胃癌病例相对于CRT、CD47低表达的病例生存时间更短，证实了CRT、CD47高表达促进胃癌细胞发生、发展，进而降低生存率。

CRT、CD47在胃癌组织中的表达与胃癌发生发展、侵袭转移相关。随着以免疫检查点抑制剂为代表的肿瘤免疫治疗临床研究迅速发展[19]，肿瘤免疫治疗引领了肿瘤治疗的新方向，胃癌的免疫治疗是一个治疗热点，CD47、CRT是有潜在价值的标志物[20]，可能为胃癌的早期诊断与免疫治疗提供潜在靶点，是胃癌治疗的新途径。