邵凯迪，王留兴，陆士新,2

0 引言

中国食管癌发病率位于全球食管癌发病率的第7位，死亡率居全球食管癌死亡率第10位[1]。而我国食管癌约90%病例是鳞状细胞癌[2]。目前食管癌的治疗方法主要是手术、放疗及化疗。迄今为止，尽管有多种可用的治疗选择，但食管癌的复发转移及其不良预后仍然是临床医学的难题。

自肿瘤干细胞（cancer stem cell, CSC）学说提出，众多学者把对食管癌的研究方向转到干细胞层面上来，以SP分选作为肿瘤干细胞的鉴定方式之一。Huang与Li等[3-4]用Hoechst 33342方法从食管癌细胞系和食管癌组织原代培养细胞中分离，鉴定出侧群（side population, SP）与非侧群（non-side population, NSP）细胞。SP细胞这群特殊的细胞具有高致瘤性、自我更新、多向分化、耐药的潜能，这些特性与肿瘤干细胞十分相似[5-7]，因此SP分选渐渐成为研究肿瘤干细胞的重要方法，为进一步研究肿瘤干细胞的生物学功能和分子机制奠定了基础。

二甲双胍（metformin, Metf）在临床上广泛用于Ⅱ型糖尿病的治疗。对健康者的血糖并无明显影响。近年来，Metf的抗肿瘤作用受到广泛重视，因Metf对CSC具有抑制作用[8]。目前，Metf对食管癌CSCs的作用及机制尚需进一步研究，本文旨在研究二甲双胍对食管鳞癌SP细胞干性的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

人食管鳞癌细胞系KYSE系列（30, 150, 180,410, 450, 510）、S1、TE1、Ec109细胞购自协和医学院基础研究所。RPMI 1640培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司。Hoechst 33342、盐酸二甲双胍购于美国Sigma-Aldrich公司。CCK-8试剂盒购于日本Dojindo化学公司。鼠抗β-actin单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。兔抗SOX2、OCT4单克隆抗体购于美国Abcam公司。山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗购于北京中杉金桥公司。

1.2 细胞培养

细胞系均用RPMI 1640（含10%胎牛血清）培养基于37℃、5%CO2的恒温培养箱培养。食管癌细胞进入对数生长期后，每2～3天用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）传代一次.

1.3 SP细胞比例检测及分选

取对数生长期的细胞，消化成单细胞悬液，PBS洗涤2遍，常规细胞计数，以1×106个细胞每毫升重悬于RPMI 1640培养基中（+2%FBS）。取1 ml重悬的液体，加入ABCG2抑制剂利血平，于37℃培养箱中避光孵育30 min，然后加入终浓度为5 μg/ml的荧光染料Hoechst 33342，于37℃培养箱中避光孵育90 min，期间间断振荡混匀。孵育结束后，用冷PBS洗涤细胞2次，离心收集，重悬于400 μl PBS中，用350 nm的紫外激光激发Hoechst 33342，用405/BP309（Hoechst蓝）滤光片测量荧光发射。流式细胞仪检测或分选。实验重复3次。

1.4 二甲双胍对细胞系SP比例的作用

取处于对数生长期食管癌KYSE150细胞，消化成单细胞悬液，然后接种在6孔板中，待长到约6孔板面积的50%时，加入含不同浓度二甲双胍的新鲜细胞培养液，每个浓度设置3个平行孔；加入不同浓度二甲双胍后24 h后常规消化细胞为单细胞悬液，通过1.3步骤进行SP细胞比例检测。

1.5 使用CCK-8方法检测不同浓度二甲双胍对SP细胞增殖的影响

取分选的SP细胞，常规细胞计数，按5 000个每孔接种于96孔板中过夜，第二天观察细胞贴壁情况良好后，每孔加入含不同浓度的二甲双胍培养基（终浓度分别为5、10、15、20 mmol/L），每个浓度设5个复孔，以不加药物的复孔为对照组。继续培养24和48 h后，加入配制好的CCK-8工作液，继续放入细胞培养箱中避光孵育2 h，于酶标仪中测定在450 nm处的吸光度（OD值）。吸光度（OD值）=实验组平均OD值-调零孔平均OD值。

1.6 二甲双胍对SP细胞平克隆形成能力的影响

取分选的SP及NSP细胞，常规细胞计数，以300个每孔接种于6孔板，每孔加入含不同浓度的二甲双胍以及10%FBS的RPMI 1640培养基悬浮细胞，每个浓度设置3个平行孔，细胞置于37℃、5%CO2培养箱培养10～14天，至细胞克隆超过50个细胞时终止培养，无水甲醇溶液室温固定10 min，结晶紫室温染色20 min后流水冲洗染料，计数每孔克隆形成数。克隆形成率=每孔克隆形成数/每孔接种细胞数×100%。

1.7 二甲双胍对SP细胞成球能力的作用

将分选后的细胞接种于6孔板中，加入不同浓度二甲双胍后48 h后将细胞常规消化为单细胞悬液，细胞计数，每孔2 000个细胞，接种于低吸附6孔板中，每个浓度设置3个平行孔，加入3 ml无血清成球培养基，将6孔板置于37℃、5%CO2培养箱中，培养10天，拍照并统计。

1.8 二甲双胍对SP细胞相关基因蛋白表达水平的影响

取分选的SP细胞， PBS洗3次后加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白的提取。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，再将蛋白转至PVDF膜。经TBST/5%脱脂奶粉室温封闭后，依次孵育相应的一抗和二抗，最后进行显色。

1.9 统计学方法

实验数据采用SPSS19.0统计学软件进行分析，本研究应用Studentttest等检验方法，用GraphPad Prism 5.0软件制图，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同细胞系的SP比例

为了明确细胞系的SP比例，本实验共检测9种食管鳞癌细胞系的SP比例，SP比例在0.2%～2%左右，且不同细胞系的SP比例不尽相同，见图1。每种细胞系至少重复三次，经多次实验后，发现KYSE150细胞SP比例较稳定，遂对其进行分选及以下实验。

2.2 二甲双胍对SP比例的影响

KYSE150细胞通过不同浓度的二甲双胍作用24 h后进行SP检测，发现对照组SP比例为（1.54±0.45）%，5 mmol/L二甲双胍作用24 h后的SP比例为（1.02±0.39）%，10 mmol/L二甲双胍作用24 h后SP比例降为（0.53±0.32）%，与对照组相比差异均有统计学意义（P=0.03和P=0.001）。由此可知二甲双胍能降低SP的比例，且SP比例的下降程度与二甲双胍浓度呈正相关性，见图2。

2.3 不同浓度二甲双胍对SP细胞增殖的影响

图1 9种不同食管鳞癌细胞系的SP(side population)比例Figure1 SP radte of nine different esophageal squamous cell lines

图2 不同浓度二甲双胍对KYSE150 SP比例的影响Figure2 Effect of different concentrations of metformin on SP rate of KYSE150

分选后的SP细胞给予不同浓度二甲双胍作用24或48 h后，通过CCK-8方法检测细胞增殖，5 mmol/L二甲双胍处理SP细胞24 h后，细胞增殖并未受到影响，其余实验组测得细胞增殖均受到不同程度抑制，且细胞的增殖抑制程度与二甲双胍浓度及给药时间呈显著正相关性，见图3。

图3 不同浓度二甲双胍对SP细胞增殖的影响Figure3 Effect of different concentrations of metformin on proliferation of SP cells

2.4 不同浓度二甲双胍对SP细胞克隆形成能力的影响

14天后观察分选后SP细胞的克隆形成情况，发现SP细胞形成克隆较NSP细胞的克隆较大且多，0 mmol/L二甲双胍SP细胞平均克隆数目为（122.2±10.31）个，NSP细胞平均克隆数目为（51.4±4.58）个，而在培养基中加入5 mmol/L二甲双胍组均未见克隆长出，差异有统计学意义（P=0.000），见图4。

2.5 二甲双胍对SP细胞成球能力的影响

食管癌KYSEl50经不同浓度二甲双胍处理48 h后接种6孔板中，10天后结束培养并观察拍照，SP细胞中0 mmol/L二甲双胍组成球数目为（26.00±2.31）个，5 mmol/L二甲双胍组成球数目为（9.67±1.20）个，两者差异有统计学意义（P=0.003）。NSP细胞中0 mmol/L二甲双胍组成球数目为（9.00±1.16）个，5 mmol/L二甲双胍组成球数目为（1.67±0.67）个，两者差异有统计学意义（P=0.005），见图5。

图4 不同浓度二甲双胍对SP、NSP细胞克隆形成能力的影响Figure4 Effect of different concentrations of metformin on clonality of SP and non-side population (NSP) cells

2.6 二甲双胍对SP细胞相关基因蛋白表达水平的影响

图5 不同浓度二甲双胍对SP、NSP细胞成球能力的影响Figure5 Effect of different concentrations of metformin on sphere-forming efficiency of SP and NSP cells

分选后的SP细胞经不同浓度二甲双胍处理24 h后提取总蛋白，发现细胞中干细胞相关基因SOX2以及OCT4的表达均有不同程度的降低，见图6。

图6 不同浓度二甲双胍对SP细胞相关基因蛋白表达水平的影响Figure6 Effect of different concentrations of Metf on expression of related genes protein in SP cells

3 讨论

我国食管癌患者就诊时大多处于中晚期，无论是手术还是放化疗，其临床效果及预后均不能让人满意，甚至大多数患者在病理性完全缓解后早期出现远处转移。据统计，我国食管癌患者5年生存率约为20.9%[9]。尽管目前有一些新药物包括靶向药应用于食管癌的治疗，但对于绝大多数终末期食管癌患者来说，预后依然相对较差。放化疗后的复发转移仍然是患者预后差的主要原因。

肿瘤干细胞被认为是肿瘤细胞内具有无限分裂潜能、自我更新能力和固有化疗耐药性的一小部分细胞[10-11]，虽只占肿瘤细胞的很少部分，但却有着强大的致瘤性、转移性和放疗抵抗性。肿瘤干细胞学说的提出很好地解释了有关肿瘤的发生、发展、转移、复发及耐药性等问题，并且提供了更多的肿瘤治疗和临床应用思路，若能够降低肿瘤干细胞的比例，将会在一定程度上降低患者的复发转移，改善肿瘤患者的预后。

目前流行病学研究显示Metf可以降低多种实体瘤的发生，范洪君等[12]以甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌，并用Metf治疗，其结果显示：Metf明显抑制食管癌的发生。Li和Wang等[13-14]的研究证明Metf抑制食管癌细胞增殖，并增强了食管癌对顺铂的敏感度。Honjo等[15]研究证明：因Metf靶向CSC和mTOR，所以Metf抑制食管癌细胞生长并且增强了食管癌细胞对5-Fu毒性敏感度。目前的研究支持以前的临床观察，即Metf用于临床治疗对食管癌患者有益，能够补充其他治疗，有效治疗食管癌。

在本实验中测得的9种食管鳞癌细胞系的SP细胞与NSP细胞比例在0.2%～2%左右，这个比例与世界文献报道的数值一致，结果表明：我们分离SP细胞的技术是科学的、可信的。SP细胞与NSP细胞比例各不相同，这与其恶性程度有一定的关系[16-17]；同时放化疗的长期应用也可以富集SP细胞，因此SP/NSP的比例也可能与细胞系来源的患者是否经过放化疗有关。KYSE150来源为日本49岁女性低分化食管鳞癌，并经过放疗，这与其有着稳定的SP/NSP比例有一定的关系。平板克隆形成是检测单个肿瘤细胞增殖能力的简单方法，能形成克隆的细胞必为能贴壁并具有增殖活力的细胞；成球实验反应了细胞的干性，有许多实验研究，通过细胞成球实验来获得干细胞[18-19]；SOX2及OCT4均为干细胞相关基因，对维持干细胞多向分化及自我更新能力有着非常重要的作用。Bao等[20]对胰腺癌的研究显示二甲双胍可以抑制胰腺癌细胞的增殖、克隆形成及成球能力，并降低CD44、EpCAM、EZH2、Notch-1、Nanog及Oct4等干性相关基因的表达从而杀伤胰腺癌干细胞。Honjo等[15]对食管腺癌的相关研究，结果显示二甲双胍可以抑制食管腺癌干性相关基因的表达并且抑制PI3K/mTOR信号转导通路增加氟尿嘧啶对食管腺癌干细胞的杀伤能力。

从本实验可看出，二甲双胍可以降低KYSE150细胞系的SP数量，抑制分选的SP细胞的增殖、平板克隆形成、成球实验等，并能够降低SOX2、OCT4等干细胞相关基因的表达，并且随着二甲双胍浓度的增高，其降低效果更明显。由此可知，二甲双胍能够在一定程度上降低食管癌细胞的干性，其可能也是通过降低干细胞相关基因的表达来杀伤干细胞，不过其具体机制仍需进一步深入研究。

二甲双胍作为临床上常用的治疗2型糖尿病的药物，其安全性及不良反应已知、价格低廉，已有多篇文章报道其对不同肿瘤的抑制作用等，通过本研究发现，二甲双胍能够杀伤肿瘤干细胞，在一定程度上降低肿瘤干细胞的比例，这可能为食管癌的临床治疗提供一个新的思路，为食管癌患者提供一个更有效的治疗方法。