达玛烷苷元抑制IKKβ— NF—κB信号通路预防烟草诱发肺癌有效性的研究
2019-01-21吴瑾刘丹杨玉光周红凤胡晓薇刘文涛
吴瑾 刘丹 杨玉光 周红凤 胡晓薇 刘文涛
摘 要：研究达玛烷苷元通过抑制IKKβ- NF-κB信号通路预防烟草诱发的肺癌。方法 选取昆明种小鼠分为对照组和达玛烷苷元不同剂量干预组建立模型，监测达玛烷苷元对小鼠血清中炎症因子水平、对IKKβ- NF-κB信号通路、对IKKβ- NF-κB信号通路下游抗凋亡相关蛋白、对肿瘤侵袭转移相关分子的影响。结果 干预组计数肺表面的肿瘤结节数和形态、颜色、大小等，可见肿瘤控制情况良好。TNF-α等炎性因子、抗凋亡蛋白、IKB激酶、ICAM-1的测定，干预组较对照组明显，且P<0.05，差异有统计学意义。结论达玛烷苷元通过抑制IKKβ- NF-κB信号通路预防烟草诱发的肺癌的发生效果明显，值得临床广泛推广应用。
关键词：达玛烷苷元；IKKβ-；NF-κB信号通路；肺癌
恶性肿瘤是人类健康的杀手，业已成为常见病、多发病，达玛烷苷元在治疗肿瘤的临床应用上取得了一定成绩[1]，得到了国际肿瘤医学界的广泛认可。本文从其上游炎症因子和下游蛋白表达的角度研究了达玛烷苷元通过如何抗炎途径来预防肺癌发生和发展的分子机制，现报道如下：
1材料与方法
1.1试剂与材料
达玛烷苷元（徐州市达玛烷苷元注射剂；2017021001）氯化钠注射液（哈药集团三精制药股份有限公司；2017101021）ELISA试剂盒（AIPUINS；33363319146）；昆明種小鼠（20-25g）。
1.2方法
1.2.1模型建立。选取昆明种小鼠分为几组（对照组和达玛烷苷元不同剂量干预组），分别暴露于烟草烟雾的动式染毒柜中，每天6个小时，每周5天，连续暴露5个月，恢复4个月之后处死，进行形态学和病理学诊断及氧化指标检测，比较各组间差异。
1.2.2达玛烷苷元对小鼠血清中炎症因子水平的影响。采用ELISA方法对不同组别中小鼠血清中TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、和IL-10水平进行测定。
1.2.3达玛烷苷元对IKKβ- NF-κB信号通路的影响。用原位杂交法和免疫组化检测肺组织IKB激酶mRNA（IKKβ mRNA）及核转录因子（NF—κB）P65亚基活性。
1.2.4达玛烷苷元对IKKβ- NF-κB信号通路下游抗凋亡相关蛋白的影响。采用Western-blot方法检测达玛烷苷元对抗凋亡蛋白Survivin（生存素）、CLAPS-1、2、XIAPS、Bcl-2、Bcl-XL的影响并且采用RT-PCR对其mRNA进行测定。
1.2.5达玛烷苷元对肿瘤侵袭转移相关分子的影响。采用ELISA方法检测细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和内皮白细胞粘附分子（ELAM-1）、基质金属蛋白酶MMP-9及MMP-2、尿激酶型纤溶酶激活物（uPA） 。
1.3数据统计
采用SPSS 26.0统计学软件进行数据处理分析，定量资料以（ ）表示，组间比较采用t检验，定性资料的组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1模型验证
2.2.1 肺癌模型。在动式染毒柜中采取动式吸入染毒，控制11%和89%的主侧流烟雾，控制总悬浮微粒（TSP）[2]浓度为119 mg·m-3，并监测CO、CO2 及O2 含量。以TSP 和CO含量为吸烟暴露指标。染毒5 d∕周，6 h∕d，连续5个月，恢复4个月。将清洁级昆明系小鼠250只，随机分为5个组。正常对照组，动物不加任何干预；干预组高、中、低剂量达玛烷苷元，染毒方式同上，给药9个月。
2.2.2 病理学诊断。染毒实验结束后，将小鼠用过量的戊巴比妥杀死，手术切除全肺，0.9 %生理盐水清洗，随即抽取部分小鼠的全肺组织，并用Tellyesniczky 固定液肺脏灌注，之后置于Tellyesniczky 固定液中至少24 h，移至70%酒精中。解剖并计数肺表面的肿瘤结节数和形态、颜色、大小等，编号、拍照。
2.2ELISA方法测定TNF-α等炎性因子：
双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法，分别测定各组小鼠血清中TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、和IL-10水平。干预组较对照组明显，且P<0.05，差异有统计学意义。
2.3 IKB激酶mRNA（IKKβ mRNA）及NF—κB P65亚基活性的测定：右下肺固定部位组织块IKKβ、mRNA 的检测，干预组较对照组明显，且P<0.05，差异有统计学意义。
2.4Survivin等抗凋亡蛋白的测定：
Westernblot检测Survivin及XIAP的表达，经图像分析系统分析，干预组较对照组明显，且P<0.05，差异有统计学意义。以与β-actin的灰度比值表示Survivin和XIAP表达的相对强度比较，干预组较对照组明显，且P<0.05，差异有统计学意义。
2.5ICAM-1等肿瘤侵袭转移相关分子水平的测定
采用ELISA方法检测小鼠血清中细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和内皮白细胞粘附分子（ELAM-1）、基质金属蛋白酶MMP-9及MMP-2、尿激酶型纤溶酶激活物（uPA），测定结果干预组较对照组明显，且P<0.05，差异有统计学意义。
3.讨论
吸烟可能提高肺癌的易感性已经成为大家都接受的共识，究竟吸烟如何影响肺癌的发生人们却不得而知，本文研究了烟草导致小鼠肺癌发生和发展机制，以IKKβ- NF-κB信号通路作为主要研究靶点，研究结果将为肺癌的预防（尤其是吸烟导致的肺癌）和治疗提供新的思路。
参考文献：
[1]熊非，刘健，李灿，等.应用纳米技术发展血液恶性肿瘤检测与治疗的新技术和新方法[J].中国基础科学，2016，18（3）：11-12.
[2]张菊. TSP-1及其受体CD47在百草枯中毒大鼠肺纤维化模型中的作用及机制初步探讨[D].川北医学院，2016.
项目名称：达玛烷苷元通过抑制IKKβ- NF-κB信号通路预防烟草诱发的肺癌的研究。
项目编号：ZHY10-288，资助单位：黑龙江省中医药管理局。
责任作者：吴瑾女 1963年12月生人教授哈尔滨医科大学附属肿瘤医院。
