汤 阳，朱晓云，冯 慧，余 悦，刘喜明＊＊

（1. 中国中医科学院广安门医院 北京 100053；2. 北京中医药大学研究生院 北京 100029）

Graves 病（Graves disease，GD）又称弥漫性毒性甲状腺肿，是一种常见的、多发的、自身免疫性内分泌代谢疾病，以弥漫性甲状腺肿和甲状腺分泌功能亢进为主要特征，其年发生率达2-3‰，女性高发，男女发病比例约为1∶4-1∶6[1]。当前GD的治疗方式主要包括抗甲状腺药物治疗、放射性碘治疗、手术等。抗甲状腺药物是GD最为常见的治疗手段，但停药后1年复发率高达50%[2]。手术或放射性碘治疗易造成甲状腺功能减退，影响患者生活质量[3]。GD 的发病机制尚未完全揭示，目前公认机体自身免疫功能紊乱是导致本病的关键因素，与Th1/Th2，Treg/Th17 细胞等失衡有关[4]。Th2 细胞能够激活B 细胞进而影响TSH 受体抗体（TSH receptor antibody，TRAb）的表达导致甲状腺机能紊乱，在GD 是发病中起关键作用。细胞因子（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13 等）作为Th2 细胞发挥作用的关键媒介，能够直接作用于B 细胞受体表面，是GD 发生、发生过程中的重要因子[5-7]。

中医药治疗GD 虽具有副作用小，复发率低等优势，但因治疗作用机制不明确，一定程度上限制了其应用与发展[8]。GD 属于中医“瘿气”、“瘿病”范畴，基本病机为气痰凝结，化痰散结法是公认的治疗GD 的基本法则[9]。课题组前期研究发现，化痰散结方能够有效改善GD 小鼠甲状腺形态与功能异常，上调脾脏Foxp3 的表达，提高Treg 细胞含量，提高机体免疫耐受能力[10]。但其深层作用机制与环节尚缺乏进一步验证。本研究在既往研究的基础上，探索化痰散结方对GD病小鼠Th2细胞相关因子的影响，阐明其免疫作用机制，为临床应用提供实验依据。

图1 各组小鼠T4、TRAb水平

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雌性BALB/c 小鼠32 只，体重17-20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司（许可证号：SCXK（京）2014-0004），饲养于中国中医科学院广安门医院动物实验中心（许可证号：SYXK（京）2014-0041），适应性饲养1 周。环境：室温22-25°C 自动控温，12/12明暗。

1.2 主要试剂与药物

重组腺病毒Ad-TSHR289 由北京东华坊生物科技有限公司包被；甲巯咪唑片（赛治），德国默克公司；化痰散结组方（夏枯草、土贝母、玄参等），北京丰泰金源药业有限公司，由中国中医科学院广安门医院药房提供；T4 及TRAb 试剂盒，法国CIS 公司；Luminex 小鼠细胞因子液相悬浮芯片，上海华盈生物医药科技有限公司。

1.3 GD小鼠模型建立与分组

适应性饲养1 周后，根据Ad-TSHR289 诱导的GD小鼠模型方法[11]，于第1、4、7 周，每次分别在小鼠胫前肌肉注射含2×109PFU AdTSHR-289 腺病毒的100 μL PBS缓冲液，共免疫3次。另设同周龄正常小鼠8只作为对照组，正常组注射100 μL PBS缓冲液。第10周时将模型小鼠随机分为模型组、化痰散结组、甲巯咪唑组，每组8只。

1.4 药物制备与干预

取化痰散结组方54 g，以适量纯水浸过药材2-3寸浸泡0.5 h，煎煮2 次，合并滤液，置于旋转蒸发仪中减压浓缩至稠膏（相当于3.05 g·mL-1生药）备用。按照20 g 小鼠每天给予0.2 mL 液体，依据人与小鼠等效剂量换算，将中药浸膏稀释至相对生药量0.702 g·mL-1，甲巯咪唑混悬于纯水中配至0.39 mg ·mL-1。正常组和模型组给予纯水，自第10 周开始灌胃给药，每天灌胃1次，连续给药6周。

1.5 血清T4、TRAb检测

将小鼠麻醉后摘眼球取血，室温静置2 h，待血清析出后，3000 r·min-1离心5 min，吸取上层血清，-80℃保存。根据T4、TRAb试剂盒的说明，进行检测。

1.6 HE染色

小鼠处死后，剥离甲状腺组织，拍照称重后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 以上，依次进行脱水、浸蜡、石蜡包埋，切片、脱蜡、水化，经HE 染色观察甲状腺组织的病理形态学变化。

1.7 细胞因子检测

取小鼠血清60 μL，采用Luminex 公司的xMAP 技术，基于微孔板的液相悬浮芯片同时进行Th2 细胞因子检测，利用梯度稀释的标准品检测信号构建标准曲线，实现准确定量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料以M±SEM方式表示，两组均数比较用配对t检验分析，多个样本均数间采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

图2 各组小组病理HE染色（×400）

图3 各组小鼠IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13的表达

2 结果

2.1 化痰散结方对GD小鼠T4、TRAb的影响

如图1 所示，与正常组相比，模型组T4 明显升高（54.98 ± 2.76 Vs 124.60 ± 8.20，P ＜0.001）；与模型组相比，化痰散结组与甲巯咪唑组T4 水平均明显下降，差异有统计学意义（97.42±5.20 Vs 124.60±8.20，P＜0.05；95.94±9.58 Vs 124.60±8.20，P＜0.05）。化痰散结组与甲巯咪唑组之间无统计学差异（P＞0.05）。

与正常组相比，模型组TRAb 明显升高，有显著性差异（32.57 ± 1.62 Vs 7.71 ± 0.61，P＜0.001）；与模型组相比，化痰散结组与甲巯咪唑组TRAb 水平均明显降低（26.27 ± 1.72 Vs 32.57 ± 1.62，P＜0.05；26.86 ±1.10 Vs 32.57 ± 1.62，P＜0.05）；化痰散结组与甲巯咪唑组之间无统计学差异（P＞0.05）。

2.2 化痰散结法对GD小鼠形态学的影响

如图2 所示，各组小鼠甲状腺HE 染色可见：正常组小鼠的甲状腺滤泡上皮细胞呈扁平状，排列整齐，滤泡腔光滑，滤泡腔内充满均匀、深红色胶质；GD 组出现甲状腺细胞滤泡上皮细胞增生明显，管腔内出现乳头状凸起，腔内胶质明显减少。经过治疗后，甲巯咪唑组小鼠甲状腺的滤泡上皮细胞增生减轻，管腔内乳头状凸起轻度缩小，胶质轻度增多；化痰散结组小鼠甲状腺滤泡上皮细胞增生明显减轻，排列整齐，局部滤泡腔内充满均匀、深红色胶质。

2.3 化痰散结法对GD小鼠Th2细胞相关因子的影响

如图3 所示，各组小鼠细胞因子水平比较：IL-4、IL-5 组间两两比较无明显差异（P＞0.05）。与正常组相比，模型组IL-6 的含量显著上升（10.05 ± 1.71 Vs 5.56±0.91，P＜0.05），经化痰散结方与甲巯咪唑干预后，GD 小鼠血清中IL-6的含量均降低，有统计学差异（6.04 ± 0.74 Vs 10.05 ± 1.71，P＜0.05；6.19 ± 0.68 Vs 10.05±1.71，P＜0.05）。

IL-10的含量，模型组较正常组显著上升（145.50±12.40 Vs 91.68 ± 9.94，P＜0.05）；与模型组比较，化痰散结组和甲巯咪唑组含量降低，但均无统计学差异（115.20 ± 12.47 Vs 145.50 ± 12.40，P＞0.05；117.30 ±14.63 Vs 145.50 ± 12.40，P＞0.05），而经药物干预后，IL-10的含量降低，差异无统计学意义。

与正常组相比，模型组IL-13 明显提高（87.01 ±6.57 Vs 136.70±5.44,P＜0.001）；与模型组相比，中药组IL-13 水平有下降趋势（114.00 ± 7.23 Vs 136.70 ±5.44，P＞0.05），西药组IL-13表达下调，但差异无统计学意义（120.90±13.93 Vs 136.70±5.44，P＞0.05）。

3 讨论

GD 作为常见的器官特异性自身免疫性疾病，其发病机制与自身免疫失调密切相关。近年来发现多种免疫细胞（Th1、Th2、Th17、Treg）与GD 的发病有关，同时这些免疫细胞间又存在着相互作用[4]。大量研究发现，GD 发病与Treg 比例下降相关[12]。本课题组在GD 模型小鼠脾脏中也同样发现Treg 比例下降，Foxp3表达下调[11]。Treg 细胞是维持机体免疫耐受，抑制效应性T 细胞活性的重要因子，能够抑制Th17细胞、Th1细胞、Th2 细胞等促炎作用[13,14]。而Th1 细胞与Th2 细胞作为Th家族的重要因子，相互间又存在着拮抗作用以维持机体免疫平衡[15]。目前认为，Treg/Th17、Th1/Th2失衡是导致GD发病的重要因素，但确切的免疫机制仍在不断探索验证。TRAb 是导致GD 自身免疫失常的关键因子，其能够与TSH 受体结合，激活腺苷酸环化酶信号系统，导致甲状腺细胞增生和甲状腺激素合成、分泌增加。TRAb 可由B 细胞活化产生，而Th2细胞是激活B 细胞增殖分化的重要因子[14]。Th2 细胞可能在GD 发病中起到最为关键的作用。IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 与IL-13 等是Th2 细胞合成，在调控体液免疫应答中发挥重要作用[14]。研究发现，这些Th2 细胞因子在GD 患者体内均存在不同程度的异常表达[5,16]。

本研究采用Luminex液相悬浮芯片法进行IL-4等Th2 细胞因子的检测，是基于该方法是目前检测细胞因子常用手段，其具有灵敏度高、需血量少等优点，尤其适用血量偏少的动物（小鼠等）进行多个细胞因子的检测[17,18]。本研究发现GD模型小鼠中Th2细胞相关因子IL-4、IL-5 与正常小鼠比较无显著性差异（P＞0.05），而细胞因子IL-6、IL-10、IL-13则存在着不同程度高表达，提示在本模型中并非所有Th2 细胞因子均是导致疾病的关键靶点。

IL-6 作为Th2 细胞分泌因子，能够促进B 细胞增殖分化，激活自身反应性T细胞，进而导致甲状腺免疫功能紊乱，诱发GD[19]。IL-6在GD中存在着高表达，经治疗后，IL-6 的水平可随之下降[20,21]。本研究发现化痰散结方与甲巯咪唑可降低GD 模型IL-6 的高表达，与上述结论一致，进一步验证了IL-6 可能是GD 的关键靶点，可作为评价疾病进展与诊疗效果的衡量指标之一。

IL-10 是多细胞分泌并具有多功能的细胞因子。早期认为IL-10主要由Th2细胞合成，抑制Th1发挥作用，近些年研究发现单核巨噬细胞、T 辅助细胞、树突状细胞，Treg 细胞等受特定刺激后均可分泌IL-10[22]。一方面，IL-10 能够抑制促炎性因子的分泌，同时又能促进B 细胞的增殖、分化和MHCII 类分子表达[23]。目前，IL-10在GD 中的表达状态尚存争议，可能与IL-10生成的多来源有关。大量报道发现GD 患者外周血中IL-10 水平明显高于正常组，并与甲状腺激素水平呈正相关，经治疗后IL-10 水平可随之降低[5,24-27]。但胡希红等[28]发现GD 患者IL-10 水平均低于健康体检者，而经治疗后IL-10水平可显著提高，其认为GD中广泛存在Treg 细胞比例降低，导致Treg 分泌的抗炎因子IL-10 的水平相应降低。本研究发现，IL-10 在GD 模型小鼠中存在高表达，因此在本模型中，Th2细胞可能是IL-10的主要来源。化痰散结组方与甲巯咪唑均能使其表达下调，但均无统计学意义（P＞0.05）。课题组前期发现化痰散结组方能够提高GD 模型小鼠脾脏Treg 比例[10]。而IL-10 作为Treg 分泌的抗炎因子可能随之增加。本研究中，化痰散结组方可能在抑制Th2分泌的IL-10 的同时，促进Treg 细胞分泌了IL-10，从而影响了其总含量的测定。

与IL-10相似，IL-13也是具有多种来源与功能的因子，与Th2 细胞关系密切。作为重要的抗炎因子，IL-13 在发挥抑制炎性细胞的同时，能通过激活B 细胞，进而产生IgG 抗体TRAb 从而导致GD 的发生。报道发现，GD 患者外周血中存在IL-13 的高表达[29]，证明IL-13在GD发病中具有一定作用。但目前关于IL-13 与GD 的相关性的研究较少，其确切作用与机制仍有待进一步揭示。本研究发现，在GD 模型中，IL-13表达增高（P＜0.001），经过药物干预后，IL-13 水平不同程度降低。

本研究以化痰散结方作为研究对象开展中医药干预GD 的实验研究，具有较强的现实意义。一方面，甲状腺弥漫性肿大与甲状腺功能亢进是GD 的核心特征，“痰结于颈”是甲状腺弥漫性肿大的关键病理状态。化痰散结法是中医治疗GD的最基本的法则，被临床工作者广泛应用。开展化痰散结方干预GD 的实验研究，对阐明中医药治疗GD 的核心机制有重要意义。另一方面，从中医证候特征角度出发，Ad-TSHR289重组腺病毒构建的GD 模型存在着明显的甲状腺肿大，具有中医“痰结”的证候特征。因此，采用化痰散结方开展实验研究符合中医辨证论治诊疗特点，其方药更具有精准性。而GD 其他常见证型（肝气郁滞、阴虚火旺等）则难以依据动物模型的体征及指标特点找到其相应证候特征，导致了临床方药与实验模型间的应用脱节，为实验开展带来一定的不可预知的问题。

本研究发现，化痰散结方能够抑制甲状腺滤泡上皮细胞增生，进而减轻甲状腺肿大，其作用优于甲巯咪唑；同时发现其能够降低GD 小鼠T4 和TRAb 水平，与甲巯咪唑疗效接近，表明化痰散结组方能够改善甲状腺分泌功能与形态学异常。同时发现，化痰散结组方能够不同程度降低IL-6、IL-10、IL-13等Th2细胞分泌因子的表达。既往研究证实，化痰散结组方能够上调GD 模型中Treg 的含量。而Treg 是维持机体免疫耐受的关键因子，能够抑制Th2细胞的表达，进一步佐证了化痰散结方对Th2细胞及其相关因子的调控作用。

综上所述，IL-6、IL-10、IL-13 作为Th2 细胞分泌的关键因子，参与GD 的发病过程。而化痰散结方可能是通过降低IL-6、IL-10、IL-13 等的表达，进而改善机体免疫应答反应，从而起到治疗GD 甲状腺功能与形态异常的作用。