潘志强，王晓敏，钱宏梁，方肇勤

（上海中医药大学基础医学院 上海 201203）

蛇床子素（Osthole，OST），又名甲氧基欧芹酚，化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，属香豆素类化合物，是从伞形科一年生草本植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实中提取出来的主要成分。其对应的中药饮片蛇床子外用具有祛风燥湿、杀虫止痒作用，内服具有温肾壮阳功效[1]，现代药理研究发现，蛇床子素具有抗氧化、抗炎镇痛、抗骨质疏松、抗肿瘤、抗过敏、抗心律失常、雄激素样和促性腺激素样等作用[2]。在抗肿瘤研究方面，近年来国内学者发现蛇床子素对乳腺癌MCF-7 细胞、肺腺癌A549细胞、肝癌Bel-7402细胞、宫颈癌Hela细胞、膀胱肿瘤T24/ADM 细胞、Walker-256 肝癌移植瘤等多种肿瘤细胞生长均具有抑制作用[3-9]，主要表现为抑制肿瘤细胞增殖或促进肿瘤细胞凋亡，并从不同的分子机制方面予以揭示。本研究在课题组前期发现蛇床子素具有抑制小鼠肾上腺皮质瘤Y1细胞、小鼠垂体瘤AtT20细胞基础上[10,11]，以人肝癌细胞株SMMC7721 为对象，发现蛇床子素抑制肝癌细胞增殖与促进细胞凋亡可以通过调控细胞内质网功能，诱发内质网应激反应从而发挥抗肿瘤的作用，兹报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

SMMC7721 人肝癌细胞为本课题组液氮保种，来源于中国科学院细胞库。

1.1.2 药物与试剂

蛇床子素（简称OST）购自上海市食品药品检验所东方药品科技实业有限公司，并溶解于DMSO 中。毒胡萝卜素（Thapsigargin，简称TG）、DMSO、MTT 购自美国Sigma-Aldrich 公司；RIPM1640 培养液、胎牛血清购自美国Gibco公司；双抗（青霉素-链霉素）、0.25%胰酶（0.02%EDTA）购自美国Hyclone 公司；Trizol购自美国Invitrogen 公 司；PrimeScript®RT reagent Kit、SYBR®Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus)Ⅱ购自TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白质定量检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自碧云天生物技术有限公司；蛋白酶、磷酸酶抑制剂&PMSF购自上海康城生物工程有限公司；凋亡试剂盒（Annexin V-FITC Apoptosis Analysis Kit）、周期试剂盒（PI/RNase Staining Solution）购自天津三箭生物技术有限公司；抗体CyclinD1、CyclinE1、CDK4、Bax、Bcl-2 购自美国Abcam 公司，抗体GRP78、GRP94、XBP-1S、PERK、p-eIF2α(Ser51) 购 自 美 国 Cell signaling technology 公司，抗体β-actin、p27Kip1购自美国Sigma-Aldrich 公司，抗体CHOP 购自美国Novus Biologicals公司。

1.1.3 基因引物序列

采用Primer3（v.0.4.0）在线软件设计引物并委托Life Technologies 公司合成有关基因引物序列及其PCR扩增产物长度（表1）。

表1 人基因上下游引物序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与治疗

SMMC7721人肝癌细胞培养于含10%胎牛血清与1%青霉素/链霉素双抗的RIPM1640 培养液中。依据不同实验目的采用药物治疗方式如下：将细胞铺入96孔板，当细胞融合度为50%时，采用20-100 μM 蛇床子素干预24 h、48 h、72 h 后以MTT 检测细胞增殖。将细胞铺入6 孔板，当细胞融合度为80% 时，采用20 μM-80 μM 蛇床子素干预48 h，采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。将细胞铺入6 孔板，当细胞融合度为80%时，采用60 μM 蛇床子素干预24 h，采用RT-qPCR 检测基因表达以及Western blot 检测蛋白表达。各实验均以0.1%DMSO作为对照组。

1.2.2 MTT检测

按照MTT 试剂说明书检测细胞增殖及活性，SMMC7721 人肝癌细胞种植于96 孔板，细胞密度为1×104/孔，次日采用蛇床子素治疗，分别在治疗24 h、48 h 和72 h 检测细胞增殖，吸弃培养液并用PBS 冲洗2 次，加入10 微升/孔0.5 mg/mL 的MTT 溶液，轻轻摇晃，放入培养箱（37℃、5%CO2）中继续培养4 h；小心吸弃上液，加入150 微升/孔DMSO 溶液；并置于振荡器上，低速振荡10 min，使其充分溶解；在酶标仪上检测OD570 nm的吸光值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡

SMMC7721 肝癌细胞经蛇床子素干预48 h 后，用预冷的PBS 冲洗细胞2 次，0.25%胰酶-EDTA 消化细胞，4℃下1000 rpm 离心5 min，与收集的悬浮细胞合并，以PBS 重悬，取1× 105个细胞，在1ml 预冷70%乙醇中4℃固定过夜。4℃下1000 rpm 离心5 min 去除乙醇，用预冷的PBS 冲洗细胞2 次；加入0.5 毫升/管PI/RNase 染液，轻轻摇匀，室温下避光孵育30 min；在流式细胞仪上计数1 × 104个细胞，根据所测定细胞的DNA含量，分析细胞周期。

细胞凋亡检测如下：将6 孔板上清液转移到1.5 mL 管中（含部分死亡的细胞），加入0.5 mL/孔PBS，轻轻摇晃，并转移到相应管中（含部分死亡的细胞）；0.25% 胰 酶-EDTA 消 化 细 胞，加 入0.5 mL/孔1 ×Binding Buffer，轻轻摇晃，并转移到相应管中。1000 rpm 离心5 min，吸弃上清溶液；加入2 mL PBS，轻轻摇晃，1000 rpm 离心5 min，弃上液，洗涤2 次；加入100 μL/管1 × Binding Buffer，轻弹管底重悬细胞；加入5 μL/管V-FITC 到各管（除空白和PI对照管外），轻轻混悬，室温下避光孵育10 min，加入2 μL/管PI到各管（除空白和V-FITC 对照管外），轻轻混悬，室温下避光孵育10 min；加入0.5 毫升/管预冷的PBS 到全部管中，轻轻混悬；采用流式细胞术检测细胞凋亡。

1.2.4 实时荧光定量PCR 技术（RT-qPCR）检测基因表达

按照TRIzol 试剂说明书抽提细胞总RNA，采用NanoDrop 2000 检测RNA 浓度和纯度，然后采用PrimeScript®RT reagent Kit 试 剂 盒 将RNA 反 转 录 为cDNA，cDNA 稀释5 倍后采用SYBR®Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus)Ⅱ进行qPCR 反应，扩增条件为95℃30 s, 95℃5 s, 60℃for 30 s for 40 cycles. 最后采用ΔΔ CT 法分析目的基因相对表达量，以β-actin 作为内参照。

1.2.5 Western blot技术检测蛋白表达

以RIPA 裂解液裂解细胞抽提总蛋白质，离心后取上清液，并加入5 × Sample buffer 在沸水中变性蛋白，然后通过BCA 法定量后采用10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白、并转膜至PVDF上。采用5%脱脂奶粉封闭膜蛋白1 h，然后采用相关蛋白抗体4℃孵育过夜，各一抗稀释浓度分别为：Bax 抗体(1∶2 000)、Bcl-2 抗体(1∶2 000)、CDK4 抗 体(1∶1 000)、CyclinD1 抗 体(1∶30 000)、CyclinE1 抗体(1∶1 000)、p27Kip1抗体(1∶1 000)、GRP78 抗体(1∶1 000)、GRP94 抗体(1∶1 000)、PERK 抗体(1∶1 000)、CHOP 抗体(1∶1 000)、p-eIF2α(Ser51)抗体(1∶1 000)、XBP-1S 抗 体(1∶1 000)、β-actin 抗 体(1∶20 000)。次日，采用含0.1% Tween-20 的TBST buffer洗涤膜，再将二抗加入5%脱脂奶粉封闭液孵育1.5 h，然后以TBST buffer 洗涤膜3 次，最后采用ELC 化学发光法显影。

1.2.6 统计分析

采用GraphPad.Prism6.0 专业软件进行统计分析与作图。计量资料以means±SD 表示，多组比较采用Newman-Keuls post-hoc 方差分析，两组比较采用ttests (nonparametric tests)，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蛇床子素的化学结构

蛇床子素，是从伞形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果实中提取出来的一种有效成分，化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，其分子结构（图1），分子式为C15H16O3，分子量244.29，可溶解于DMSO。

图1 蛇床子素分子结构图

2.2 蛇床子素抑制SMMC7721肝癌细胞增殖

与对照组（Con）比较，蛇床子素干预24 h 后，100 μM 蛇床子素对SMMC7721 肝癌细胞增殖抑制率为36.76%（P＜0.05）；干预48 h 后，60-100 μM 蛇床子素对SMMC7721 肝癌细胞增殖抑制率为30.84%-52.49%（P＜0.05）；干预72 h 后，40-100 μM 蛇床子素对SMMC7721 肝癌细胞增殖抑制率为32.7%-73.15%（P＜0.05）（表2）。提示蛇床子素具有显著抑制SMMC7721肝癌细胞增殖的作用。

表2 蛇床子素对SMMC7721肝癌细胞增殖的抑制率（±s，n = 4）

表2 蛇床子素对SMMC7721肝癌细胞增殖的抑制率（±s，n = 4）

注：与对照组比较，*表示P ＜0.05，**表示P ＜0.01。下同

浓度/μM 0(Con)20 40 60 80 100抑制率/%72 h 0.16±2.06 21.37±5.88 32.97±4.71*47.70±4.54*56.93±1.37**73.15±2.84**24 h-0.18±1.57 12.60±9.81 22.45±5.39 19.57±5.64 21.19±5.59 36.76±8.31*48 h-0.15±3.12 15.33±3.97 24.96±4.66 30.84±3.42*40.23±3.84*52.49±4.05**

2.3 蛇床子素对SMMC7721肝癌细胞周期的影响

与Con 组比较，60 μM 蛇床子素干预SMMC7721肝癌细胞48 h 后，G1 期细胞数增加、G2 期和S 期减少（P＜0.05），而0.1 μM 毒胡萝卜素（TG）导致G1期显著增 加（P＜0.05）（图2）。提示蛇床子素能够将SMMC7721肝癌细胞阻滞在G1期，从而发挥抑制肝癌细胞生长的作用。

图2 蛇床子素对SMMC7721肝癌细胞周期的影响

2.4 蛇床子素对SMMC7721 肝癌细胞周期蛋白表达的影响

与Con 组比较，60 μM 蛇床子素显著抑制CyclinD1、CyclinE1和p27Kip（1CDKN1B）蛋白表达，然而0.1 μM TG 均显著抑制CyclinD1、CyclinE1、p27Kip1和CDK4蛋白表达，（图3）。提示蛇床子素和毒胡萝卜素通过抑制CyclinE1的表达，阻止细胞进入S期，从而达到抑制细胞增殖的作用。

图3 蛇床子素对细胞周期蛋白表达的影响

2.5 蛇床子素诱导SMMC7721肝癌细胞凋亡

采用20-80 μM 蛇床子素干预SMMC7721 肝癌细胞48 h 后，与Con 组比较，60-80 μM 蛇床子素具有诱导SMMC7721肝癌细胞晚期凋亡的作用（P＜0.05）（图4）。提示蛇床子素能够诱导SMMC7721 肝癌细胞凋亡。

2.6 蛇床子素对SMMC7721肝癌细胞凋亡蛋白的影响

与Con 组比较，不同浓度蛇床子素干预SMMC7721 肝癌细胞48 h 后，对凋亡抑制蛋白Bcl-2表达无明显影响，但是60-80 μM 蛇床子素显著抑制促凋亡蛋白Bax 表达（图5）。提示蛇床子素诱导SMMC7721 肝癌细胞凋亡与抑制Bcl-2 和Bax 蛋白表达关系不大。

图4 蛇床子素促进SMMC7721肝癌细胞凋亡

图5 蛇床子素对Bax和Bcl-2蛋白表达的作用

2.7 蛇床子素量效对SMMC7721 肝癌细胞内质网应激基因表达的影响

与Con 组比较，不同浓度蛇床子素处理SMMC7721 肝癌细胞48 h 后，均显著促进GRP78、DDIT3（CHOP）和ATF4基因表达（P＜0.05）；20 μM 蛇床子素显著促进GADD34和EIF2A基因表达（P＜0.05），（表3）。提示 蛇 床子素通过上调GRP78、DDIT3、ATF4和EIF2A等基因表达，诱发SMMC7721肝癌细胞发生未折叠蛋白反应过程，参与内质网应激过程。

表3 不同浓度蛇床子素对内质网应激标志基因mRNA表达的作用

与Con 组比较，不同浓度蛇床子素均显著促进FOXO3、RICTOR 和SGK1 基因表达（P＜0.05）；80μM蛇床子素显著促进GDF15 基因表达（P＜0.05），结果（表4）。提示蛇床子素通过诱导内质网应激引起细胞增殖基因表达抵御性增强。

表4 不同浓度蛇床子素对细胞增殖相关基因mRNA表达的作用

2.8 蛇床子素对SMMC7721 肝癌细胞内质网应激蛋白表达的影响

与Con 组比较，0.1 μM TG 非常显著增强GRP78、XBP-1s、GRP94 蛋 白表达，60 μM 蛇床子素可促进CHOP、XBP-1s 蛋白表达，然而对蛇床子素对GRP78、GRP94、PERK、p-eIF2α(Ser51)蛋白表达无明显影响（图6）。提示蛇床子素通过促进CHOP 及XBP-1s 蛋白表达，诱发SMMC7721肝癌细胞内质网应激发生。

图6 蛇床子素对内质网应激相关蛋白表达的影响

3 讨论

蛇床子素是蛇床子的主要活性成分，属香豆素类化合物，具有抗氧化、抗炎镇痛、抗骨质疏松、抗肿瘤、抗过敏、抗心律失常、雄激素样和促性腺激素样等作用[2]。而蛇床子在祖国传统医学中药性味辛、苦、温，归肾经，外用具有祛风燥湿、杀虫止痒作用，内服具有温肾壮阳的功效；用于阴痒带下，湿疹瘙痒，湿痹腰痛，肾虚阳痿，宫冷不孕等病证。虽然古代本草没有记载蛇床子可治疗类似肿瘤相关的病证，但是近现代药理学研究发现蛇床子及蛇床子素具有抗肿瘤活性[34]。本文在我们前期探索蛇床子素可抑制Y1 小鼠肾上腺皮质瘤细胞和AtT20小鼠垂体瘤细胞增殖基础上[10,11]，进一步研究了蛇床子素对肝癌细胞增殖的影响，在体外发现蛇床子素具有明确的抑制SMMC7721人肝癌细胞增殖和促进肝癌细胞凋亡的作用。并深入揭示蛇床子素通过影响细胞周期以抑制细胞增殖，诱导内质网应激以促进细胞凋亡发生，从而揭示了蛇床子素体外抗肝癌作用的分子机制。

本研究发现蛇床子素具有抑制体外培养的SMMC7721 人肝癌细胞增殖作用，且呈现剂量依赖性关系，并随药物干预时间延长，呈现更强的肿瘤生长抑制效应。有研究报道，蛇床子素对MCF-7乳腺癌细胞及MCF-7/ADR 多药耐药性乳腺癌细胞均具有增殖抑制作用，IC50值约58 μM[12]。20-100 μg·mL-1蛇床子素对小鼠肺腺癌LA795 细胞和人肝癌Bel-7402 细胞增殖也具有显著抑制作用，且相同浓度下对LA795 细胞增殖抑制作用更强烈[13]。30-120 μM 蛇床子素对人前列腺癌DU145 细胞增殖有明显的抑制作用，并呈现明显的时间浓度依赖性，而且蛇床子素可诱导DU145细胞凋亡[14]。40-200 μM 蛇蛇床子素均可明显抑制人宫颈癌Hela 细胞增殖及诱导细胞凋亡[15]。50-200 μM蛇床子素呈剂量依赖性地抑制人肺癌NCI-H460 细胞的增殖及凋亡[16]。从文献报道提示，蛇床子素对体外培养的多种肿瘤细胞增殖均具有抑制作用，说明蛇床子素可以作为抗肿瘤研究的候选中药单体成分，值得关注。

然而，蛇床子素抑制肝癌细胞增殖是否与细胞周期有关，本研究发现，蛇床子素可以导致SMMC7721肝癌细胞G1 期细胞数增加,G2 期和S 期细胞数减少；进而检测细胞周期调控相关蛋白，发现蛇床子素显著抑 制CyclinD1、CyclinE1 和p27Kip1蛋 白 表 达。 而CyclinD1、CyclinE1 蛋白在调节细胞周期过程中起到非常重要的作用，是细胞周期素依赖激酶（CDK）的正调节因子；正常情况下，CyclinD1、CyclinE1 与CDK 相结合，从而促使细胞从G1 期进入S 期，使细胞发生分裂与增殖。研究表明，细胞周期紊乱是肿瘤细胞尤其是恶性癌变的重要特征，蛇床子素可通过促进G1 期阻滞以及诱导细胞凋亡以抑制MCF-7 乳腺癌细胞增殖[17]。此外，蛇床子素能明显改善阿尔茨海默病模型大鼠空间学习记忆能力，减少神经元凋亡，增加S期细胞百分率，促进G2/M 期细胞进一步分裂，增强细胞增殖活性，调节细胞周期，有利于维持神经元正常的生理功能[18]。提示蛇床子素通过抑制CyclinE1 的表达，阻止细胞进入S 期，从而达到抑制肝癌细胞增殖的作用，而蛇床子素调控细胞周期蛋白是其抗癌作用的重要靶点。

在发现了蛇床子素抑制SMMC7721 肝癌细胞增殖基础上，本文进一步观察到蛇床子素还可以诱导肝癌细胞凋亡发生。本研究表明，蛇床子素具有诱导SMMC7721 肝癌细胞晚期凋亡的作用，并呈现量效关系，从而抑制肿瘤生长。且发现蛇床子素显著抑制促凋亡蛋白Bax表达，然而对凋亡抑制蛋白Bcl-2表达无明显影响，提示蛇床子素诱导SMMC7721 肝癌细胞凋亡与抑制Bcl-2和Bax蛋白表达关系不大。研究表明，蛇床子素也能抑制人肝癌HepG2 细胞增殖、诱导其发生凋亡，能显著降低Bcl-2 蛋白表达，但对Bax 蛋白表达无影响[19]，提示蛇床子素对SMMC7721 和HepG2 肝癌细胞作用机制的差异性。同样，有报道蛇床子素呈现剂量与时间依赖性抑制人骨肉瘤SAOS-2 细胞活力，且增强促凋亡蛋白Bax表达上调，减弱抗凋亡蛋白Bcl-2 表达[20]。提示蛇床子素诱导SMMC7721 细胞凋亡与其他细胞凋亡发生机制的不同。

由于内质网应激也是诱导细胞凋亡的重要途径，本研究发现不同浓度蛇床子素具有显著增强GRP78、DDIT3（CHOP）和ATF4基因表达作用，而且GADD34和EIF2A基因表达也受蛇床子素上调，且蛇床子素显著促进CHOP及XBP-1s蛋白表达蛋白表达，提示蛇床子素通过诱发SMMC7721 肝癌细胞发生未折叠蛋白反应过程，参与内质网应激。内质网是细胞内的一个精细的膜系统，有粗面内质网和光面内质网，主要参与膜蛋白的合成和分泌、蛋白质的正确折叠、Ca2+储藏、脂质与胆固醇合成和代谢等过程。外在或内在因素的影响，导致内质网中出现错误折叠与未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态称为内质网应激。细胞内未折叠蛋白反应主要涉及3条信号通路：即双链RNA 依赖的蛋白激酶样ER激酶（PERK）通路，肌醇需酶1（IRE1）通路，活化转录因子6（ATF6）通路。其中，CHOP（DDIT3）即激活凋亡分子C/EBP 同源蛋白，正常情况下CHOP处于低表达状态，当发生内质网应激时，内质网应激诱导剂毒胡萝卜素等均可显著激 活PERK、IRE1 和ATF6 这3 条信号通路以增强CHOP的表达。文献报道蛇床子素通过降低GRP78蛋白水平、增加CHOP 蛋白表达以抑制成骨细胞增殖[21]，而蛇床子素对其他肿瘤细胞内质网功能的影响未见报道。本研究发现，蛇床子素具有明确的促进GRP78及其下游CHOP、ATF4和GADD34分子表达的作用，诱导未折叠蛋白反应，推测可能是诱发SMMC7721 肝癌细胞凋亡的主要原因。此外，蛇床子素均显著促进FOXO3、RICTOR、SGK1和GDF15基因表达，推测蛇床子素可能通过诱导内质网应激引起细胞增殖基因表达抵御性增强有关。

综上所述，本研究发现蛇床子素通过将细胞阻滞在G1期抑制SMMC7721肝癌细胞增殖，并引起内质网功能紊乱从而持续性诱导内质网应激反应以导致肝癌细胞凋亡发生。该研究丰富了蛇床子素抗肝癌作用的新药理学机制。