黄 艳，吴凌翔，马 喆，顾沐恩，黄儒德，李 璟＊＊，吴璐一，刘慧荣，马晓芃，张军峰，张建斌，吴焕淦＊＊

（1. 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 上海 200437；2. 上海市针灸经络研究所 上海 200030；3. 上海中医药大学针灸免疫效应重点研究室 上海 200030；4. 南京中医药大学 南京 210023）

1 引言

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis, CAG）以胃黏膜腺体萎缩或消失为主要病变，是临床常见病和多发病。本病的病因及发病机制不清，可表现为局限性或广泛性的胃黏膜固有腺萎缩，多并发肠化、上皮内瘤变及炎性反应[1]。Correa 提出人胃癌的发生模式为正常胃黏膜-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-小肠型肠上皮化生（以下简称“肠化”）-上皮内瘤变（即中重度异型增生）-胃癌（肠型）[2]，尤其是肠上皮化生，被认为是萎缩的典型标示及胃癌的前兆。1978 年WHO 组织将CAG 列为胃癌的癌前状态。我国目前CAG 的发病率较高，2011 年流行病学调查显示，CAG 发病率占受检人群的23.2%。CAG 伴重度肠上皮化生和不典型增生的癌变率为2.0%-13.8%，而我国CAG 癌变率为3%-5%[3]。CAG的患病率随着患者年龄及病程的增长而升高，但近年来呈低龄化趋势。目前西医主要是通过药物治疗和内镜下微创缓解患者的临床症状，但存在一定的副反应，患者依从性差。针刺、艾灸等方法治疗CAG 的疗效确切，能改善患者临床症状，提高生活质量[4-6]。其效应机制尚不明确，本研究从外周血全基因组基因表达谱的角度，采用RNA-seq 高通量测序方法筛选CAG 大鼠外周血的差异表达基因，结合生物信息学分析其生物学功能，以及炎症和肿瘤相关的信号通路，采用RT-qPCR 验证差异表达基因，为针灸治疗CAG的效应机制提供实验室资料和研究方向。

2 材料与方法

2.1 实验动物与伦理

清洁级健康雄性Wistar 大鼠，6 周龄，体重（120±5）g，均由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证编号：2013001806740，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。适应性喂养，其饲养环境：室内温度24±2℃，湿度为40%-60%，每日明暗时间12 h/12 h。本实验严格按照美国国立卫生研究院制定的动物保护制度执行；遵循《中华人民共和国动物保护法》及上海中医药大学实验动物管理委员会制定的实验动物使用以及保护条款。

2.2 实验试剂及材料

N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍（日本东京株式会社，日本），戊巴比妥钠（Sigma，美国），磁珠蛋白A（Invitrogen，美国），QubitRNA BR 检测试剂盒（Thermo Fisher，美国），Trizol（Invitrogen，美国），Agilent 2100 RNA 芯片（Illumina，美国），RNA 6000 Nano 总RNA 分析试剂盒（Illumina，美国），Truseq 试剂盒（Illumina，美国），Truseq DNA 样本制备试剂盒（Illumina，美国），Real-Time PCR System（Roche，美国）。

2.3 模型制备与鉴定

采用随机的方法将大鼠分成2部分，即正常大鼠6只、造模大鼠18只。采用MNNG 诱导剂结合夹尾刺激与饥饱失常法复制CAG 大鼠模型。动物分笼饲养，每日自由饮用浓度为150 mg·L-1的MNNG 溶液，足量进食2 d，禁食1 d，循环实施。每周用专用夹尾夹夹住大鼠尾部，持续10 min，使之保持激怒、争夺。造模结束后随机抽取正常组、造模组各2只大鼠进行模型鉴定。

2.4 干预方法

将造模成功的大鼠随机分为隔药饼灸组、电针组、西药组、模型组，每组4 只；结合前面的正常组4只，共5组。

隔药饼灸组：用附子、肉桂、黄芩等药物按照一定比例加工碾粉备用。药粉与黄酒混合后，用模具制成直径为1 cm，厚度为0.45 cm 的药饼，选用精制艾绒制成底座为1 cm，重90 mg 的艾炷。将制好的药饼置于自制灸具内，置于大鼠中脘穴和气海穴上，上置艾炷，每天1次，每次每穴1壮，持续4周。

电针组：选取大鼠中脘穴和气海穴，直刺2 mm，于针柄处接通G6805-2 型电针仪，采用连续波100 Hz，输出电流1-3 mA，强度以大鼠下肢轻颤为度，每次20 min，每日1次，持续4周。

西药组：予叶酸悬浊液1.0 mL/100 g（即叶酸2 mg·kg-1）灌胃，每天1次，持续4周。

正常组和模型组不予干预，只做与其它3 组相同的抓取和固定。

穴位定位参照《实验针灸学》（余曙光主编）大鼠标准穴位图谱定位。中脘穴：大鼠腹白线上，脐上20 mm；气海穴：大鼠腹白线上，肚脐下12.5 mm。

2.5 标本采集及处理

取材前各组大鼠禁食不禁水24 h，称量体重后，2%戊巴比妥钠麻醉（40-50 mg·kg-1）后，采用EDTA 抗凝管收集腹主动脉血液5 mL，加Trizol 溶液3 mL，冻存-80 ℃冰箱备用。

2.6 总RNA抽提的质控

采用Trizol 法提取总RNA，对抽提的总RNA 进行检测，观察其纯度、浓度及完整性。并采用安捷伦2100生物芯片分析系统对所得总RNA进行质量控制，RIN 值在8.0 以上的样本为合格样本，将应用于RNAseq。

2.7 文库建立和高通量测序

每组取3 个样本，采用酶切的方式将各组总RNA随机打断成短片段，再以片断后的RNA 作为样本模板，用六碱基随机引物，进行RT-PCR 先合成cDNA 的第一链，并加入LIFE INVITROGEN 试剂盒（RNase H、缓冲液、dNTPs 和DNA 聚合酶I），进行RT-PCR 合成cDNA 第二链，采用试剂盒纯化cDNA，然后采用EB 缓冲液洗脱柱子，完成末端修复、末端加碱基A，再加测序接头index，然后通过Uracil-N-Glycosylase 降解第二条链。将所得产物用1%琼脂糖凝胶电泳，取出合适的大小片段，进行PCR 扩增。建好文库后，采用高通量测序仪Illumina HiSeqTM 2000测序。本部分由深圳华大基因股份有限公司完成。

表1 引物的序列表

2.8 生物信息学分析

本部分主要采用了TOPHAT 和CUFFLINKS 结合分析的方法。过滤掉FPKM 和覆盖度较低的序列，减少背景噪声，组装的转录本然后再与已知的mRNA 参考序列比较，得到所有基因的mRNA 转录本。差异表达基因筛选条件为：log2FC（Fold change）≥1 为基因表达上调；log2FC≤-1为基因表达下调，probility＞0.6。

2.9 RT-qPCR验证

选取Foxo3、Ifnk、Uba52、S100a1、Nod2共5 个差异表达基因，以GAPDH为内参基因，各组4 个样本进行RT-qPCR验证。基因引物序列见表1。所有数据采用2-△△Ct法进行分析。

2.10 统计学方法

采用SPSS22.0 统计软件包分析数据，描述数据时符合正态分布的数据采用均数±标准差（±s）表示；对于不符合正态分布的数据，采用中位数（四分位数）[Median(P25-P75)]表示。通过正态分布检验的数据，采用独立样本t检验的方法。若不符合正态分布，采用非参数检验。检验水准α=0.05，P＜0.05 为有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠的大体情况观察

正常组的大鼠毛发光泽，紧密贴身，两眼有神，尾淡红，体型健壮，大便呈颗粒状。模型组的大鼠毛发蓬乱且毛发易脱落，眼珠无神，尾淡白或苍白，体型瘦削，活动迟缓，进食少，粪便偏软、时不成形。隔药饼灸组、电针组和西药组的大鼠毛发稀疏，较模型组改善、精神转佳，活动较灵活，体重有所增加，进食稍增加，粪便偏软、时不成形。

3.2 CAG大鼠外周血的基因表达谱研究

3.2.1 CAG大鼠外周血的差异表达基因

CAG 大鼠与正常大鼠外周全血基因表达谱变化。与正常组比较，CAG 组有1 542 个差异表达基因，其中上调基因725个，下调基因817个（图1）。

图1 CAG大鼠模型组外周全血基因表达谱MA图

3.2.2 基因本体（GO）分析

与CAG 大鼠外周全血差异表达基因相关的GO分析提示，分子功能：与抗氧化活性、催化活性、金属辅酶活性、核酸结合转录因子活性、信号转导、转录因子活性、蛋白结合及结构分子活性相关。生物学途径：与单一生物过程、信号、应激反应、调节生物过程、突触、正反馈和负反馈、代谢过程、免疫系统、细胞成分和生物作用、生物粘附等相关。细胞组件：与细胞连接、细胞外基质、大分子复合物、膜、细胞器、突触等相关（图2）。

图2 CAG大鼠外周血差异表达基因的GO分析

3.2.3 信号通路（KEGG）分析

与CAG 大鼠外周全血差异表达基因相关的KEGG 分析提示，主要与细胞生长和死亡、细胞运动、运输和分解代谢、信号转导、信号分子和相互作用、癌症、心血管疾病、内分泌代谢疾病、免疫疾病、细菌感染、神经退行性疾病、物质依赖、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢、糖链生物合成和代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素的代谢、其他氨基酸的代谢、萜类化合物和聚酮化合物的代谢、核苷酸代谢、异生素生物降解和代谢、衰老、消化系统、内分泌系统、环境适应、免疫系统、神经系统、感觉系统等相关（图3）。

3.3 隔药饼灸、电针和西药对CAG 大鼠外周血表达基因谱的影响

MNNG 诱导的CAG 大鼠在隔药灸干预作用下，外周血较模型组的差异表达基因2 956 个，其中上调1 012 个，下调1 944 个。下调基因数目明显多于上调基因数目，占65.76%。电针干预作用下，外周血较模型组的差异表达基因3 136 个，其中有的上调885 个，有部分下调2 251 个。下调基因数目明显多于上调基因数目，占71.78%。在西药组的干预下，外周血较模型组的差异表达基因1 308 个，其中有的上调703 个，有部分下调605个。上调基因数目稍多于下调基因数目，占53.75%。

图3 CAG大鼠外周全血差异表达基因的KEGG分析

3.3.1 隔药饼灸干预CAG 模型大鼠外周全血的基因表达谱研究

（1）隔药饼灸干预CAG 模型大鼠外周血的差异表达基因

隔药饼灸组大鼠与CAG 模型大鼠外周全血基因表达谱变化，与模型组比较，隔药饼灸组有2 956 个差异表达基因，其中上调1 012个，下调1 944个（图4）。

图4 隔药饼灸组与CAG模型组外周全血基因表达谱MA图

（2）基因本体（GO）分析

隔药饼灸干预CAG 大鼠的外周全血差异表达基因相关的GO 分析提示，分子功能：与抗氧化活性、催化活性、金属辅酶活性、核酸结合转录因子活性、信号转导、转录因子活性、蛋白结合及结构分子活性相关。生物学途径：与单一生物过程、信号、应激反应、调节生物过程、突触、正反馈和负反馈、代谢过程、免疫系统、细胞成分和生物作用、生物粘附等相关。细胞组件：与细胞连接、细胞外基质、大分子复合物、膜、细胞器、突触等相关（图5）。

图5 隔药饼灸组大鼠外周全血基因表达谱GO分析

（3）KEGG分析

隔药饼灸组外周全血的差异基因的KEGG分析结果提示，其中基因涉及KEGG主要与细胞生长与死亡、细胞运动、运输与分解代谢、信号分子和相互作用、信号转导、蛋白质折叠与分选、复制与修复、癌症、免疫疾病、物质氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢、消化系统、免疫系统、神经内分泌系统等相关（图6）。

3.3.2 电针干预CAG 模型大鼠外周全血的基因表达谱研究

（1）电针干预CAG 模型大鼠外周血的差异表达基因

电针组大鼠与CAG 模型大鼠外周全血基因表达谱变化，与模型组比较，电针组有3136 个差异表达基因，其中上调885个，下调2251个（图7）。

图6 隔药饼灸组大鼠外周全血基因表达谱KEGG分析

图7 电针组与CAG模型组外周全血基因表达谱MA图

（2）GO分析

电针干预CAG 大鼠的外周全血差异表达基因相关的GO 分析提示，分子功能：与抗氧化、催化活性、金属辅酶活性、核酸结合转录因子活性、信号转导、转录因子活性、蛋白结合及分子活性相关。生物学途径：与单一生物过程、信号、应激反应、调节生物过程、正反馈和负反馈、代谢过程、免疫系统、细胞成分和生物作用、生物粘附等相关。 细胞组件：与突触、细胞器、细胞膜、细胞、细胞连接、细胞外基质、大分子复合物等细胞组件相关（图8）。

图8 电针组大鼠外周全血基因表达谱GO分析

（3）KEGG分析

电针组外周全血的差异基因的KEGG分析结果提示，其中基因涉及KEGG主要与细胞生长与死亡、细胞运动、运输与分解代谢、信号分子和相互作用、信号转导、蛋白质折叠与分选、复制与修复、癌症、免疫疾病、物质氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢、消化系统、免疫系统、神经内分泌系统等相关（图9）。

图9 电针组大鼠外周全血基因表达谱KEGG分析

3.3.3 西药干预CAG 模型大鼠外周全血的基因表达谱研究

（1）西药干预CAG 模型大鼠外周全血的差异表达基因

西药组大鼠与CAG 模型大鼠外周全血基因表达谱变化。与模型组比较，西药组有1 308 个差异表达基因，其中上调703个，下调605个（图10）。

图10 西药组与CAG模型组外周全血基因表达谱MA图

（2）GO分析

西药干预CAG 大鼠的外周全血差异表达基因相关的GO 分析提示，分子功能：与抗氧化活性、催化活性、金属辅酶活性、核酸结合转录因子活性、信号转导、转录因子活性、蛋白结合及结构分子活性相关。生物学途径：与单一生物过程、信号、应激反应、调节生物过程、突触、正反馈和负反馈、代谢过程、免疫系统、细胞成分和生物作用、生物粘附等相关。细胞组件：与细胞连接、细胞外基质、大分子复合物、膜、细胞器、突触等相关（图11）。

图11 西药组大鼠外周全血基因表达谱GO分析

（3）KEGG分析

西药组外周全血的差异基因的KEGG分析结果提示，其中基因涉及KEGG主要与细胞生长与死亡、细胞运动、运输与分解代谢、信号分子和相互作用、信号转导、癌症、免疫疾病、物质氨基酸代谢、能量代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢、消化系统、免疫系统、神经内分泌系统等相关（图12）。

图12 西药组大鼠外周全血基因表达谱KEGG分析

3.4 隔药饼灸影响的CAG 外周全血差异表达基因的验证

RNA-seq 测序结果提示，CAG 大鼠外周全血Foxo3、Ifnk和Uba52较正常组下调，S100a1、Nod2较正常组上调。采用RT-qPCR 验证这5 个基因，结果发现CAG大鼠外周全血基因Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表达均较正常组降低（P＜0.05），IfnkmRNA 表达有下降趋势，但差异无统计学意义；CAG 大鼠外周全血S100a1mRNA、Nod2mRNA 表达均较正常组上调（P＜0.05）。经3 种干预方法作用后，隔药饼灸组、电针组、西药组CAG大鼠外周全血Foxo3mRNA、Uba52mRNA均较模型组上调（P＜0.05），S100a1、Nod2较模型组下调（P＜0.05），三组IfnkmRNA 表达较模型组有上升趋势，但差异无统计学意义（图13）。

图13 各组部分外周全血差异表达基因的验证

4 讨论

CAG 在中医学古籍中没有相关记载，2010年中华中医药学会正式将CAG 归属为“胃痞”、“胃痛”、“嘈杂”、“痞满”、“腹胀”等范畴。本病发病多与禀赋不足、劳倦过度、饮食不节、情志不调、感受外邪等因素相关，病机错综复杂，病情迁延难愈，早期多因外邪、饮食、情致等所伤为实证，后期病机逐渐演变为脾胃虚弱等虚证，属本虚标实。相对于西医学主张对症治疗的观点，中医学更侧重于整体调节和辨证论治。针刺、艾灸等方法治疗CAG 的疗效确切，相关临床研究已证实[4-9]，本研究采用隔药饼灸方法治疗CAG，以充分发挥经络、腧穴及药物的治疗作用。

随着基因芯片和RNA-seq 高通量测序技术的发展，CAG 疾病相关的基因及其生物学功能逐渐被揭示，CAG 胃黏膜组织部分炎症因子、促癌基因和抑癌基因异常表达。我们思考隔药饼灸对CAG 发挥调节免疫、细胞凋亡的作用，以及调控促癌基因与抑癌基因的平衡。本研究从全基因组基因表达谱的角度，采用RNA-seq 高通量测序的方法，探讨MNNG 诱导的CAG 外周全血基因表达谱，并筛选隔药饼灸中脘、气海穴逆转CAG 大鼠外周全血的差异表达基因。

本研究发现，MNNG 诱导的CAG 大鼠在3 种干预方法的作用下，外周血差异表达基因均有不同程度的上调或下调，其中隔药饼灸和电针调控的差异基因数目较西药多，可能与针灸作用的多环节、多靶点相关。3 种干预方法作用下的KEGG 途径富集分析主要与细胞生长与死亡、细胞运动、运输与分解代谢、信号分子和相互作用、信号转导、癌症、免疫疾病、能量代谢、脂质代谢、辅助因子和维生素代谢、核苷酸代谢、消化系统、免疫系统、神经内分泌系统等相关，富集基因数目最多的通路主要与蛋白翻译、信号转导、癌症、免疫系统、消化系统等相关。

GAG 大鼠外周血差异基因表达谱广泛，我们筛选了差异倍数较显著的Foxo3、Uba52、S100a1、Nod2、Ifnk等5个基因，RNA-seq测序结果提示，CAG大鼠外周全血Foxo3、Ifnk和Uba52较正常组下调，S100a1、Nod2较正常组上调。采用RT-qPCR 对RNA-seq 测序结果进一步验证，结果发现CAG 大鼠外周全血基因Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表达均较正常组降低，S100a1mRNA、Nod2mRNA 表达均较正常组升高，IfnkmRNA表达均较正常组亦有降低趋势；经3 种干预方法作用后，CAG 大鼠外周全血Foxo3mRNA、Uba52mRNA 表达均较模型组升高，S100a1、Nod2表达均较模型组降低，IfnkmRNA 表达较模型组亦有上升趋势。研究表明，叉头蛋白Foxo3 参与调节细胞周期、细胞凋亡等的病理过程，可通过激活PI3K-AKT 信号通路参与CAG癌前病变的调节，与消化道肿瘤的发生密切相关[10-14]。S100a1是钙结合蛋白S100家族的成员，在细胞中既有信号分子的作用同时又可作为分泌蛋白起作用，与多种神经病变、癌症相关[15，16]，研究表明，S100a1 可通过刺激胃癌细胞内钙水平在胃癌细胞呈高表达趋势[17]。UBA52 是由泛素和核糖体蛋白L40 组成的融合蛋白，其主要参与了糖尿病肾病的发病机制，并与结肠癌、乳腺癌等相关[18-21]。HP 感染是CAG 重要的危险因素，NOD2 作为核苷酸结合寡聚化结构域蛋白家族的关键成员，可通过识别和清除外源性病原微生物、介导天然免疫，是抵御Hp 感染的第一道防线，并参与Hp 相关胃癌的发生、发展过程[22-25]。Ifnk（interferon kappa,IFN-κ）是近来发现的Ⅰ型干扰素家族成员，在先天免疫应答期起着重要作用，具有与其它Ⅰ型干扰素家族成员相似的抗病毒感染的功能[26,27]。综上，本研究所验证的Foxo3、Uba52、S100a1、Nod2等4 个差异基因的mRNA 表达趋势与测序结果一致，可能是CAG 的潜在的生物标志物；在隔药饼灸的干预作用下，Foxo3、Uba52、S100a1、Nod2的mRNA 表达水平均有不同程度的逆转，可能是隔药饼灸干预CAG 大鼠的外周血的作用机制之一。

基因表达谱研究为我们提供了研究方向，下一步将从表观遗传的角度结合RNA-seq 基因表达谱，研究DNA 甲基化和长链非编码RNA 在艾灸治疗CAG 的效应机制。