周小仙，陈泽慧,2，陈安林，董泽令，杨 欢，周 婷，陈先恋，刘清亮

(1.遵义医学院附属医院 医学检验科，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 检验医学院临床微生物免疫教研室，贵州 遵义 563099)

羊布鲁菌是布鲁菌属中最常见、毒性最强、病情最严重的亚种，其感染人体后主要寄生在单核巨噬细胞内，而肝脏又是人体巨噬细胞最丰富的地方，因此被羊布鲁菌感染后可引起肝脏多种形式病变(血清转氨酶的升高、肝脏慢性化脓性炎症、肉芽肿性炎症、肝脓肿等)，其发生率高达50%[1-2]。临床上选择抗菌药物治疗羊布鲁菌感染患者时，应该考虑肝毒性小且在细胞内具有抗菌活性的药物[3]。目前，临床上常选用四环素、利福平及氨基糖苷类等抗菌药物治疗布鲁菌感染患者，但单一抗菌药物的使用常导致布鲁菌感染患者出现服药时间长、治疗效果差、易复发的现象。WHO推荐联合用药(多西环素和利福平联用6周、多西环素和强力霉素联用45 d、多西环素和链霉素联用21 d)治疗布鲁菌感染患者[4]。但多西环素、利福平等抗菌药物长期服用将会增加药物毒副作用，尤其是对肝脏的损害。近年来已出现利福平、复方新诺明对羊布鲁菌耐药的报道[5]，所以迫切需要寻找毒副作用小且不易产生耐药性的药物治疗羊布鲁菌感染患者，尤其是合并肝脏疾病的患者。中药具有副作用小、不易产生耐药的优势，部分中药对肝脏、肾脏还有保护作用[6-7]。研究发现，瓜菱对肺炎链球菌、淫羊藿对铜绿假单胞菌及肺炎链球菌、白芍对鲍曼不动杆菌及肺炎链球菌[8]、白芨对金黄色葡萄球菌[9]均具有一定抑菌作用。但这些中药对羊布鲁菌抗菌作用的研究尚未见报道。因此，本研究从具有抗菌作用的中药中筛选出28种中药探讨其对羊布鲁菌的抗菌作用，为临床布鲁菌感染患者治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂 分析天平FA1004N(深圳市无限量衡器有限公司)，旋转蒸发仪RE-2000A(上海亚荣生化仪器厂)，VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪(法国梅里埃公司)，DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，98-1-B型电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)等。

Tritonx-100细胞裂解液(北京索来宝科技有限公司)，基因组DNA提取试剂盒(美国Sigma公司)，PCR扩增试剂盒(上海生工生物公司)，Chromas 2.6.6软件及NCBI数据库等。

1.2 实验中药 瓜蒌、木蝴蝶、木香、姜黄、杜仲、白芨、白芍、紫草、山豆根、钩藤、黄药子、猪牙皂、黄柏、女贞子、益母草、连翘、三七、虎杖、百部、菌味、拳参、半夏、龙胆草、玄参、黄精、苦瓜、天冬、厚朴共28种中药均购自遵义医学院附属医院中药房。

1.3 实验菌株 根据前期研究结果，选择遵义医学院附属医院临床分离的且能成功构建布鲁菌侵染巨噬细胞模型的菌株作为研究对象[10]。挑取血琼脂平板上单个生长菌落，采用VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪进行生化鉴定。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离细菌基因组，16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，Chromas 2.6.6软件分析测序结果，测序结果导入NCBI数据库中BLAST同源比对分析实验菌株的菌种。16S rDNA通用引物序列如下:

27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R: 5'-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3'。

1.4 制备中药提取物

1.4.1 制备中药水提取液 称取瓜蒌、木蝴蝶、木香、姜黄、杜仲、白芨、白芍、紫草、山豆根、钩藤、黄药子、猪牙皂、黄柏、女贞子各10 g，分别放入相应圆底烧瓶内，用100 mL蒸馏水浸泡30 min，以电热套加热煮沸(约80 ℃)，常压回流3次，每次2 h。收集常压回流3次后的滤液后用旋转蒸发器旋转浓缩至1 g/mL，置于4 ℃冰箱备用。

1.4.2 制备中药乙醇或乙酰乙酯提取液 称取益母草、连翘、三七、虎杖、百部、菌味、拳参、半夏、龙胆草、玄参、黄精、苦瓜、天冬药材各10 g，分别放入相应圆底烧瓶内，用100 mL 75%乙醇浸泡30 min，以电热套加热煮沸(约80 ℃)，常压回流3次，每次2 h。收集常压回流3次后的滤液后用旋转蒸发器旋转浓缩至1 g/mL，置于4 ℃冰箱备用。按以上步骤制备厚朴乙酰乙酯提取液，置于4 ℃冰箱备用。

1.5 抑菌试验 参照2016年CLSI推荐的细菌药物敏感性试验检测方案M100S测定28种中药提取物对羊布鲁菌的MIC，且每种药物做3个重复[11]。细菌生长质量控制以M-H肉汤作为阴性对照，菌液为阳性对照。

2 结果

2.1 细菌生化与分子生物学鉴定结果 实验菌株经VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪鉴定为羊布鲁菌，可信度为99.9%。该菌株的16S rDNA PCR扩增产物在1 500 bp处出现1条特异性条带(见图1)。经北京六合华大基因科技有限公司测序所得的16S rDNA序列拼接后全长为1 252 bp(见图2)，在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行BLAST比对分析显示，其与Brucellamelitensis(羊布鲁菌)相符，同源性达到了98%(见图3)。

M：DNA Marker，A、B、C和D均为实验菌株16S rDNA PCR产物。图1 羊布鲁菌16S rDNA PCR扩增结果

图2 羊布鲁菌16S rDNA PCR扩增产物测序结果

图3 羊布鲁菌16S rDNA PCR扩增产物序列比对结果

2.2 抑菌试验结果 28种中药提取物抗菌效果最好的是紫草、虎杖、钩藤，MIC均为15.6 mg/mL，其次是女贞子、山豆根、连翘、黄精、白芍次之，MIC均为31.25 mg/mL；黄药子、玄参、厚朴、益母草、瓜菱的MIC均为62.5 mg/mL，半夏、黄柏无抗菌作用(见表1)。

表1 28种中药提取物对羊布鲁菌体外抗菌活性

药物名称各种中药提取物不同质量浓度下细菌生长情况(mg/mL)50025012562.5031.2515.607.80阴性对照阳性对照MIC(mg/mL)紫草Lithospermum erythrorhizon虎杖Polygonum cuspidatum钩藤Uncaria rhynchophylla女贞子Fructus ligustri lucidi山豆根Radix sophorae tonkinensis连翘Forsythia suspensa黄精Polygonatum sibiricum白芍Cynanchum otophyllum黄药子Dioscoreaceae玄参Radix scrophulariae厚朴Magnolia officinalis rehd益母草Leonurus artemisia瓜菱Melon rhombus龙胆草Elephantopusscaber百部Stemona japonica菌味Bacterial taste木香Common vladimiria root苦瓜Momordica charantia L.天冬Radix asparagi杜仲Eucommia ulmoides猪牙皂Fructusgleditsiae拳参Polygonum bistorta L.三七Panax notoginseng木蝴蝶Oroxylum indicum姜黄Curcuma longa L.白芨Buddleja alternifolia maxim半夏Pinellia ternata黄柏Cortex phellodendri--------------------------++--------------------++++++++-----------------+++++++++++-------------+++++++++++++++--------++++++++++++++++++++---+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++----------------------------++++++++++++++++++++++++++++15.6015.6015.6031.2531.2531.2531.2531.2562.5062.5062.5062.5062.50125.00125.00125.00125.00250.00250.00250.00500.00500.00500.00500.00500.00500.00>1000.00 >1000.00

“-”表示无细菌生长，“+”表示细菌生长。

3 讨论

布鲁菌病是由布鲁菌进入人体后引起的人兽共患乙类传染病，全球每年新发病例超过50万，呈升高趋势[5]。羊布鲁菌属于高致病性微生物，能在皮肤完好的情况下，通过呼吸道、皮肤黏膜、口腔等各种组织侵入机体引起致病。本次研究的实验菌株本课题组在前期研究中发现，其对BALB/c小鼠具有较强的毒力作用，其感染后可引起小鼠体重下降，肝脏、脾脏系数增高，出现脂肪变性、核固缩等的病理组织改变[12]。羊布鲁菌致病力强，一旦发生感染后病情发展难以控制，严重威胁人类身体健康，已成为急需解决的公共卫生问题。临床上常根据羊布鲁菌生化反应、基因及蛋白组成的不同进行鉴定，但因单一鉴定方法容易出现错误的鉴定结果，最好采用两种方法同时进行鉴定[13]。而本次研究通过采用VITEK 2 Compact 全自动微生物鉴定仪及16S rDNA基因序列分析均鉴定为羊布鲁菌，保证了试验菌株鉴定结果的可靠性。

本次研究表明28 种中药提取物中除半夏、黄柏外，其余对羊布鲁菌均有不同程度的抗菌作用。其中紫草、虎杖、钩藤对羊布鲁菌抗菌效果最好；女贞子、山豆根、连翘、黄精、白芍次之；猪牙皂、拳参、三七、木蝴蝶、姜黄、白芨抗菌效果较差。文献报道紫草主要成分紫草素对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌、白色念珠菌、蜡状芽孢杆菌、沙门氏菌均具有较好的抗菌作用[14]。此次研究也显示紫草对羊布鲁菌同样具有较好的抗菌效果，可能与紫草素发挥抗菌作用相关。Su等[15]研究发现，虎杖对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及甲型链球菌等病原菌均具有一定程度的抗菌作用，可能是与虎杖中主要含有蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类、香豆素类以及一些脂肪酸类化合物相关。虎杖中分离的大黄素、大黄素-8-葡萄糖苷等醌类化合物对金黄色葡萄球菌和肝炎双球菌也具有一定的抑菌作用[16]。因此，虎杖对羊布鲁菌的作用机制可能是通过上述一种或几种化合物而发挥抗菌作用，值得进一步研究。钩藤的主要化学成分包括生物碱类、黄酮类及萜类等，其中钩藤碱占了钩藤总碱的28.9%[17]。江芳等学者在体外实验中发现，钩藤碱对甲型副伤寒杆菌，福氏痢疾杆菌，鲍式痢疾杆菌等肠道致病菌有一定的抑制作用，且高质量浓度的绒毛钩藤水提物对鼠伤寒沙门氏菌TA98 菌株和TA100 菌株产生毒性损伤[18]。本次研究显示钩藤水提物对羊布鲁菌有较好的抑菌抗菌效果，推测可能是钩藤碱发挥了作用，但仍需进一步证实。根据目前的研究状况，针对羊布鲁菌感染患者，临床可选用抗菌效果较好的中药辅以治疗，这对减少抗菌药物长时间使用，避免抗菌药物的耐药性及毒副作用的产生具有十分重要的意义，但在最大化提高中药的治疗效果方面，还应对其主要成分的抗菌机制进行深入研究。