张成江，江 艳，陈儒嘉

(遵义医学院药学院 分析化学教研室，贵州 遵义 563099)

九香虫(aspongopuschinensis)，又称屁巴虫、打屁虫，属半翅目蝽科，主要分布于我国的南部地区[1-3]。九香虫是一种传统的药食两用昆虫，药用于中医治疗胸胁胀痛、慢性肾病、阳痿早泄、疼痛等方面具有显著疗效[4-6]。现代研究表明，九香虫还具有抗菌[7]、抗癌[8]以及抗凝血[9]等作用。九香虫的食用价值也很高，含有多种脂肪酸、蛋白质、氨基酸、几丁质和多种人体所需的微量元素[10-11]，所以九香虫也是一种独具地方特色的保健食品。近年来，从九香虫中分离出30余种天然活性成分，包括内酰胺、去甲肾上腺素衍生物、倍半萜化合物等，应用到多种疾病的治疗研究当中。

固相微萃取(SPME)是一种集采样、萃取、浓缩和进样于一体的新型样品前处理技术[12-13]。SPME具有操作简单、方便快捷、易自动化，以及易于联用等特点。固相微萃取采样过程萃取纤维不接触样品，对挥发性成分富集效果好、萃取容量小，不改变生物挥发性成分的释放平衡，是一种非侵入性的无损采样方法，因此，SPME技术特别适合于采集各种生物活体释放的挥发性成分。目前还没有查到相关文献报道固相微萃取法分析活体及炮制九香虫的气味成分。本实验采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)分析活体及炮制九香虫的气味成分，为进一步合理开发和利用九香虫的药食两用价值提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent GC-6890/MS-5973气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；手动固相微萃取装置(美国Supelco公司)；萃取纤维头分别为100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、85 μm聚丙烯酸酯(PA)和60 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯(PDMS/DVB)(美国Supelco公司)；HP-1510型气相色谱顶空加热器(上海济成分析仪器有限公司)；AL204电子天平(Mettler -Toledo公司)；15 mL顶空萃取瓶。

1.2 材料 活体九香虫采自贵州省遵义市新舟镇；炮制九香虫由活体虫经过温水浸泡2 h后，翻炒制得。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取过程 从大小品种相同的数只活体九香虫中，随机挑取一只活体九香虫或称取1.0 g炮制九香虫放入15 mL萃取瓶，盖上瓶盖，将萃取瓶放入顶空加热器中，设置一定的萃取温度(活体九香虫在室温下进行萃取，炮制九香虫萃取温度为70 ℃)。将固相微萃取装置的针头插入萃取瓶中，推出纤维头，萃取一定的时间(活体九香虫萃取10 min，炮制九香虫萃取60 min)，收回纤维头，拔出固相微萃取装置，再将针头插入GC-MS仪器的进样口(温度为250 ℃)，推出纤维头解吸一定时间(活体九香虫解吸3 min，炮制九香虫解吸5 min)，收回纤维头，拔出针头，进行GC-MS分析。

1.3.2 活体九香虫的GC-MS分析 色谱条件：HP-5石英毛细管色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为高纯氦气，体积流量1.0 mL/min，进样模式为不分流，进样口温度250 ℃；程序升温：初始温度为40 ℃，以4 ℃/min的速度升至160 ℃，保留2 min，再以10 ℃/min升至200 ℃，260 ℃后运行2 min。

1.3.3 炮制九香虫的GC-MS分析 色谱条件：HP-5色谱柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为高纯氦气，体积流量1.0 mL/min，进样模式为不分流，进样口温度250 ℃；程序升温：初始温度为65 ℃，以20 ℃/min的速度升至120 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，260 ℃后运行2 min。

1.3.4 质谱条件 离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；电离源EI；电子能量70 eV；活体九香虫无溶剂延迟，炮制九香虫溶剂延迟4 min；质量扫描范围m/z 30～500。

根据所得到的总离子流色谱图中各质谱信息，用面积归一化法计算各组分的相对质量分数，通过计算机检索与NIST05、Demo及Wiley7质谱标准图库对比，并结合相关文献资料，对质谱图相似度大于80% 的化合物进行收集整理，确定各色谱峰所对应的化学成分。

2 结果

2.1 活体九香虫气味成分分析 取一只活体九香虫，放入15 mL萃取瓶中，人为刺激使其放出臭气后，使用100 μm PDMS萃取头，室温下萃取10 min，在250 ℃的进样口解吸3 min，GC-MS分析，其总离子流色谱图如图1所示，各成分相对含量见表1。

2.1.1 成分分析结果 从活体九香虫气味成分中共鉴定出16种化合物，可检出各成分的峰面积占总峰面积的97.00%。从相对含量来看，其中含量较高(超过10%)的物质有4种，含量最高的物质为3,4-二甲基-2-己烯(30.65%)，其余3种分别为十三烷(16.71%)、反-2-癸烯基乙酸(15.32%)和反-2-己烯醛(12.22%)；剩余的12种化合物中有4种相对含量超过1%和8种相对含量小于1%。从化学组成来看，16种化合物中大多数为烷烃类、烯烃类和醛类，其中烷烃类有：十二烷、十三烷、十四烷以及十五烷，共占总含量18.02%；烯烃类有：3,4-二甲基-2-己烯、1-甲基-环己烯、1-醇-2-癸烯及1-十三烯，共占总含量34.49%；醛类有：反-2-己烯醛、2-辛烯醛、反-2-癸烯醛和反-2-十二烯醛，共占总含量20.25%；而剩余4种化合物为：2-己烯-1-醇乙酸酯(8.51%)、反-2-庚烯酸乙酯(0.04%)、反-2-癸烯基乙酸(15.32%)和5-乙基-2-呋喃酮(0.38%)。

2.1.2 实验重现性考察 按“2.1.1”项下萃取条件进行萃取进样分析，重复6次，以活体九香虫气味成分的总峰面积值为考察指标，计算其RSD为2.58%，符合实验要求，表明该方法重现性良好，适用于活体九香虫气味成分的分析鉴定。

图1 活体九香虫气味成分的总离子流色谱图

表1活体九香虫气味成分分析结果

序号保留时间(min)化合物名称分子式相对分子质量相对质量分数(%)相似度(%)14.143 反-2-己烯醛C6H10O98.0712.22 9528.8303,4-二甲基-2-己烯 C8H16112.2130.6586310.2182-己烯-1-醇乙酸酯 C8H14O2142.198.5194410.7435-乙基-2-呋喃酮 C6H8O2112.120.3887511.412反-2-辛烯醛C8H14O126.200.2785611.7961-甲基-环己烯 C7H1296.170.2383713.278反-2-庚烯酸乙酯 C9H16O2156.220.0490815.807十二烷 C12H26170.331.2096917.764反-2-癸烯醛 C10H18O154.257.69831017.9262-癸烯-1-醇C10H20O156.262.94941118.5501-十三烯 C13H26182.350.67981218.904十三烷 C13H28184.3616.71971319.385反-2-十二烯醛 C12H22O182.300.06931421.306十四烷 C14H30198.390.05981521.792反-2-癸烯基乙酸 C12H22O2198.3015.32831623.804十五烷 C15H32212.420.0597

2.2 炮制九香虫的固相微萃取条件优化

2.2.1 萃取头选择 固相微萃取的核心是萃取涂层(即萃取头)，涂层的种类与厚度是影响分析方法灵敏度与选择性的最重要因素。因此，本实验选择3种不同的萃取头(100 μm PDMS、85 μm PA和60 μm PDMS/DVB)分别对炮制九香虫气味进行萃取分析，按“1.3.1”项所述实验步骤，以检测出的总峰面积和峰个数作为衡量指标，进行萃取头考察，结果见图2。从图可看出，使用100 μm PDMS共检出49个峰；85 μm PA共检出13个峰；60 μm PDMS/DVB共检出40个峰，结果表明，100 μm PDMS具有最佳的萃取效果。从总峰面积分析，100 μm PDMS萃取头检出的总峰面积最大，分别是另外两种萃取头所得总峰面积的115.57和16.03倍。根据所得的峰个数和总峰面积结果，因此选择100 μm PDMS作为最佳的萃取头，进行后续实验分析。

图2 萃取头类型对炮制九香虫气味成分萃取效果的影响

2.2.2 萃取温度 萃取温度升高能加快待测物的挥发，有利于增加涂层的吸附量，但温度过高也会让待测物与萃取涂层之间的分配系数降低，导致影响萃取效果。实验分别考察了在40、50、60、70和80 ℃的萃取温度，以检出的色谱总峰面积和峰个数作为衡量指标，结果见表2和图3。从表2可以看出，当温度较低时，色谱峰个数变化不大，萃取温度从40 ℃升至50 ℃时，仅增加了7个峰；而当温度升到60 ℃以上时，色谱峰个数变化比较明显，温度每增加10 ℃，峰个数都增加了15个以上。从图3总峰面积来看，随着温度升高，总峰面积不断增大，从40 ℃到60 ℃增幅较小，60 ℃到80 ℃增幅较大。由于萃取头上纤维涂层吸附挥发性物质时发生的是放热反应，高温可能会降低涂层对挥发性物质的吸收能力，而且高温对顶空萃取瓶的气密性要求也比较高，所以萃取温度一般不宜太高。当温度升高到80 ℃的时候，3次平行实验得到的总峰面积数量相差很大，结果表明在80 ℃时，萃取效果也不太稳定。综上，选择70 ℃作为萃取温度。

表2萃取温度、萃取时间与解吸时间对色谱峰个数的影响

萃取温度(℃)峰个数增加数萃取时间(min)峰个数增加数解吸时间(min)峰个数增加数40 25—1550—148—503273049-1349160 4917457122552370 65166077675428082177575-210562

图3 萃取温度对炮制九香虫气味成分萃取效果的影响

2.2.3 萃取时间 实验分别选择15、30、45、60和75 min为萃取时间进行检测分析，以检出的色谱总峰面积和峰个数作为考察指标，结果见表2、图4。由表2和图4可以看出，萃取时间对峰个数与总峰面积的影响基本一致，萃取时间由15 min增加到30 min时，组分数基本保持不变，总峰面积变化也较小；萃取时间从30 min增加至60 min时，峰个数和总峰面积有较大的增长，并在60 min时达到最大值；而当萃取时间继续增加，到75 min时，峰个数略有下降(从77降至75)，总峰面积则有较明显的减小。萃取的过程其实是一个纤维涂层不断吸附与析出的动态过程。吸附时间过短，许多物质来不及挥发出，不被纤维涂层吸附，或者吸附量太少而不被检测出，所以萃取过程需要一定的时间。但萃取时间也不宜过长，萃取时间太长，则会有吸附在涂层上的容易被挥发的物质重新析出，或萃取能力下降，反而会导致萃取效果降低[14]。正如表2及图4所示，当萃取时间达到60 min，萃取效果达到最佳，此时达到了物质吸附与解吸的动态平衡，所以本实验选60 min为最佳的萃取时间。

图4 萃取时间对炮制九香虫气味萃取效果的影响

2.2.4 解吸时间 解吸时间对分析结果也会有较大的影响，解吸时间太短，会有一些吸附得紧密的物质无法解吸，而解吸时间太长，在较高的进样口温度下，可能会影响萃取头的使用寿命。实验分别选择1、3、5、7和10 min为解吸时间进行检测分析，以检出的色谱总峰面积和峰个数作为考察指标，结果见表2和图5。从表2及图5可以看出，随着解吸时间的增加，峰个数与总峰面积均有增加，但峰个数增加的并不明显，总峰面积增加明显。一般在检出峰个数差异不明显的前提下，选择总峰面积最大的条件作为最佳萃取条件。但从峰形来看，当解吸时间大于5 min时，色谱峰的峰形出现了展宽、变形的现象，导致影响其积分结果。综合考虑，选择5 min作为最佳的解吸时间。

综上实验结果，炮制九香虫气味的固相微萃取最佳萃取条件分别为100 μm PDMS的萃取头，萃取温度为70 ℃，萃取时间为60 min，进样口温度为250 ℃，解吸时间为5 min。

图5 解吸时间对炮制九香虫气味萃取效果的影响

2.3 炮制九香虫气味成分分析 称取1.0 g，在最优固相微萃取条件下所得炮制九香虫的气味经GC-MS分析，总离子流色谱图见图6，成分分析结果见(表3～4)。

图6 炮制九香虫气味成分的总离子流色谱图

表3炮制九香虫气味成分分析结果

序号保留时间(min)化合物名称分子式相对分子质量相对质量分数(%)相似度(%)14.391 反-2-己烯酸C6H10O2114.140.07 9324.592 丁酸丙酯 C7H14O2130.181.10 8235.041 正辛酸 C8H16O2144.212.68 8645.166 十二烷 C12H26170.342.79 8355.824 2-辛烯酸 C8H14O2142.2020.919366.286苯乙酸 C8H8O2136.150.37 8176.499 壬酸 C9H18O2158.240.71 9186.752 1-十三碳烯C13H26182.350.35 9796.899 十三烷 C13H28184.3630.85 98107.284反,反-2,4-十二碳二烯醛 C12H20O180.290.06 86118.150 正癸酸C10H20O2172.260.54 89128.418 十八醛 C18H36O268.480.07 85138.567 反-2-己烯基己酸 C12H22O2198.300.2782148.735 2,4-二氨基甲苯 C7H10N2122.170.2391158.910 反-2-壬烯酸 C9H16O2156.220.77 83169.084 1,3-二氢-5-甲基-2 -苯并咪唑-2-酮C8H8N2O148.161.52 91179.698 (2E)-2-己烯酸-(2E)-2-己烯酯 C12H20O2196.291.81 951810.301 2-乙烯基-4,5 -(亚甲二氧基)苯甲醛C10H8O3176.170.61 831910.734 十五烷C15H32212.420.33 862010.823 反-2-(1-戊烯基)-呋喃 C9H12O136.190.28 812112.063 月桂酸C12H24O2200.320.75 912212.353 1-十四烷醇 C14H30O214.390.19 902313.495 1-十三醇 C13H28O200.360.39 942413.630二苯甲酮C13H10O182.220.06932514.457 1-十五烯 C15H30210.400.13982615.038 5-二十碳烯 C20H40280.530.13 922715.963 11-十五碳烯醇 C15H30O226.400.23 892816.187 肉豆蔻酸 C14H28O2228.371.61 962916.585 11-十六碳烯酸乙酯 C18H34O2282.460.18863016.822肉豆蔻酸乙酯 C16H32O2256.430.34933117.1171-十四碳烯 C14H28196.370.19893217.2529-十六碳烯酸 C16H30O2254.410.0783

(续表)

序号保留时间(min)化合物名称分子式相对分子质量相对质量分数(%)相似度(%)3317.6081-二十六碳烯 C26H52364.700.20853418.171正十五酸 C15H30O2242.400.29973518.679乙酸正十七烷基酯C19H38O2298.510.12873620.155棕榈酸 C16H32O2256.424.68993720.3449-十六碳烯酸乙酯 C18H34O2282.461.05963820.6091-二十六烷醇 C26H54O282.710.25893920.733棕榈酸乙酯 C18H36O2284.480.68944023.3282,13-十八烷二烯醇 C18H34O266.460.38914123.411油酸 C18H34O2282.461.94984223.826亚油酸乙酯 C20H36O2308.500.74974323.9256-十八碳烯酸 C18H34O2282.460.6894

表4炮制九香虫气味成分种类及含量统计结果

2.3.1 成分分析结果 从炮制九香虫气味成分中共鉴定出43种化合物，可检出物质的峰面积占总峰面积的81.61%。从相对含量来看，其中含量较高(超过10%)的物质有2种，分别是十三烷(30.85%)和2-辛烯酸(20.91%)；含量超过1%的化合物有9种，含量小于1%的化合物有32种。从化学组成来看，43种化合物中大多数是脂肪酸和酯类化合物(见表4)，其中有15种酸(36.36%)、8种酯(6.02%)、5种烯烃(1.01%)、5种醇(1.42%)、3种烷烃(33.97%)、3种醛(0.75%)、2种酮(1.58%)、2,4-二氨基甲苯(0.23%)和反-2-(1-戊烯基)-呋喃(0.28%)。且大多数化合物集中在C8～C18，其中分子式为C18H34O2的有四种同分异构体。

2.3.2 实验重现性考察 按“2.2”项下最优固相微萃取条件进行萃取进样分析，重复6次，以炮制九香虫气味成分的总峰面积值为考察指标，计算其RSD为1.45%，符合实验要求，表明该方法重现性良好，适合于炮制九香虫气味成分的分析鉴定。

3 讨论

文献报道九香虫的臭味物质主要为烷烃、烯醛或酮类物质。侯晓辉等[3]报道采用注射器收集活体九香虫胸部臭孔的喷射液(防御性物质)，通过直接进样分析“臭气”成分，研究表明除了检测到醛和酮类物质外，还检测出烷类和烯类，其中含量相对较高的有十三烷、反-2-己烯醛和3,4-二甲基-2-己烯，共占总量的97.68%，十三烷为九香虫“臭气”的主要挥发性成分。随后，他们[15]又采用温水浸泡法获得九香虫的防御性物质水溶液，固相微萃取-气相色谱质谱分析该水溶液的挥发性成分。结果表明，相对百分含量最高的为反-2-己烯醛(88.54%)，其次为2-甲基-4-戊烯醛(5.16%)、十三烷(3.43%)等，九香虫防御性物质水溶液成分主要是烯醛和烷烃类化合物。作者[6]还采用顶空固相微萃取分析九香虫粉的挥发物成分，其中相对含量较高的是十三烷、十二烷、3-己烯酸和反-2-己烯醛，分别占总量的92.29%、2.71%、2.26%和0.56%，九香虫粉挥发物主要由烷类物质所构成。活体九香虫会释放出一种极具刺激性的气味，本研究采用活体九香虫气味进行采样分析，其气味成分信息更加全面真实，更能反映九香虫的实际气味，结果与文献报道的挥发物成分种类基本一致，但因采集样品和分析方法不同，其所得成分组成含量略有差异。研究表明，活体九香虫气味成分中含量较高的物质为3,4-二甲基-2-己烯(30.65%)、十三烷(16.71%)、反-2-癸烯基乙酸(15.32%)和反-2-己烯醛(12.22%)。实验测出的几种烷烃、烯烃均具有一定刺激性气味，其中3,4-二甲基-2-己烯的相对含量最高，为活体九香虫气味的主体成分；其次为十三烷，十三烷是一种有机溶剂，若被吸入或摄入后对身体有害，具刺激作用，为防御作用的主体物质[3]。另外，在4种醛中，反-2-己烯醛的含量最高，反-2-己烯醛具有强烈的刺激性、蔬菜样气味[3]，所以反-2-己烯醛可能是活体九香虫臭味的来源之一；气味成分中反-2-癸烯醛有鸡、家禽肉味；反-2-辛烯醛具有脂肪和肉类气味，对眼睛、皮肤有刺激作用。这些烷烃类、烯烃类和醛类物质的共存作用构成了活体九香虫独特的气味特征。

炮制九香虫气味成分分析，其种类和含量最多的是脂肪酸类，根据文献报道，九香虫含有大量的脂肪油，而实验测出的许多成分与九香虫油脂成分吻合，所以炮制九香虫的气味可能是其经过高温翻炒后体内的脂肪油外溢产生的特殊气味。且高温翻炒过程也可能导致其原本气味成分转化生成新的化合物。气味中的15种酸，占总含量36.36%，包括7种饱和脂肪酸、7种不饱和脂肪酸和1种芳香酸(苯乙酸)。其中，棕榈酸有良好的抗癌作用和抗炎作用，但棕榈酸的使用也有一定局限，其不适合于患有高血压或糖尿病的患者，因此炮制九香虫在作药用时应根据患者本身的情况而定。实验测出的3种烷烃(十二烷、十三烷和十五烷)均具有刺激性，占总含量33.97%。其中，十三烷的含量最高(30.85%)，为炮制九香虫气味的主体成分；其次是酯类，一般脂肪酸酯没有臭味，只有一些油脂气，其中的丁酸丙酯还具有水果香气；剩余的成分含量均不高，高浓度的十八醛有椰子香味，稀释过后有杏仁味或桃花香气，苯甲醛有特殊杏仁气味，二苯甲酮具有玫瑰香气，呋喃也有其特殊气味，这些气味成分混合在一起，就形成了炮制九香虫特殊的气味。

活体九香虫气味成分分析，可检出的各物质的峰面积占总峰面积的97.00%；而炮制九香虫气味成分分析，检出物质的峰面积仅占总峰面积的81.61%。其原因可能是活体九香虫的气味是在自然状态下进行的原味采集，信息组成比较全面真实；而炮制九香虫是九香虫经过高温翻炒制成，可能其中某些易挥发的物质挥发损失，剩余成分含量太低，导致其无法检出。气味成分分析结果表明活体与炮制九香虫的气味成分有显著差异：活体九香虫气味成分大多数是烷烃类、烯类和醛类化合物，气味多是九香虫释放的刺激性臭气；而炮制九香虫气味成分则多数是脂肪酸、酯类等化合物，气味多是九香虫经高温翻炒后体内外溢产生的脂肪油。

本实验采用SPME-GC-MS分析活体及炮制九香虫的气味成分，在最佳固相微萃取条件下，所得信息全面真实、数据准确可靠，且SPME-GC-MS技术操作简单、方便快捷，适用于快速、全面分析九香虫的气味成分。随着九香虫的应用越来越广泛，其药食两用价值的研究也必将更加深入，该研究为进一步合理开发和利用九香虫的药食两用价值提供了参考依据。