王树艳，沈前程

（1.广西农业职业技术学院，广西 南宁 530007；2.广西金陵农牧集团有限公司，广西 南宁 530049）

高质量的DNA在开展基因组分子生物学试验和动物分子育种检测中起基础性的作用[1]，通过提取鸡DNA，通过PCR方法鉴定鸡矮脚基因[2]、隐性白基因[3]。鸡血样中含有丰富的DNA。提取高质量鸡血样DNA提取方法多样[4]，各有优缺点。现行的鸡血样DNA提取存在过程复杂，使用有机试剂或价格昂贵等缺点[5-7]。为更有效地提取鸡血样DNA，本试验在前人研究的基础上，经过改进建立了一种简便、快捷的鸡抗凝血DNA提取方法，它优于现行的血液DNA提取试剂盒。该法提取的DNA，质量稳定，纯度高。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂分光光度仪（Nanno-100微量）；PCR仪（SEDI G Thermo Cycler）；凝胶成像仪（美国威泰克）；2xTaq PCR Master Mix（天根生化科技（北京）有限公司），TIANamp Blood DNA Kit试剂盒；EDTANa2、无水乙醇、NaCl等其他试剂为化学分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 鸡抗凝血采集 翅下静脉采集12只 3%EDTANa2（抗凝剂:血液=1:9）抗凝的青脚麻羽公鸡血样（广西金陵种鸡场），用以下方法分别提取DNA。

1.2.2 试剂盒提取DNA 按血样DNA提取试剂盒说明书进行，取20 μL抗凝血，加入20 μL Proteinase K溶液，混匀；加200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10 min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮；加200 μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12 000 r/min，离心30 s，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500 μL已加入无水乙醇缓冲液GD，12 000 r/min，离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600 μL已加入无水乙醇漂洗液PW，12 000 r/min，离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复操作上步骤；12 000 r/min，离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50 μL洗脱缓冲液TB，室温放置2～5 min，12 000 r/min，离心2 min，将溶液收集到离心管中（约1 h）。

1.2.3 本法提取DNA 取鸡抗凝血100 μL，加入250 μL 裂 解 液（50 mm EDTA-Na2、2%SDS、0.19 mol NaCl），放入56～60℃水浴锅30 min；加入600 μL 3 mol NaCl，颠倒3～5次混匀，入90℃水浴锅30 min；4 000 r/min，10 min，取上清200 μL（含DNA）转移到另一新的1.5 mL EP管中，加入95%乙醇400 μL，颠倒3次；4 000 r/min，2 min，小心弃上清；加入600 μL 70%乙醇、颠倒3～5次，4 000 r/min，2 min；小心弃弃上清，收集沉淀室温吹干，加入200 μL TB溶解。

1.2.4 DNA样品纯度和浓度测量 Nanno～100微量分光光度仪测定,读取260 nm和280 nm的吸光度值A，计算DNA的含量，单位ng/μL，DNA纯度以A260/A280表示，纯度（A260/A280）应在标准的1.7～2.0之间。

1.2.5 DNA样品完整性测量 提取DNA后稀释到48 ng/μL，取6 μL采用1%琼脂糖凝胶电泳（含GoldView核酸染色剂，6 μL/100 mL），电压110 V，30 min。在凝胶成像系统下观察，拍照记录。

1.2.6 结果分析 应用SPSS软件对以上数据进行分析。结果用mean±S表示，统计显著性以P＜0.05判断。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法耗时和费用该试验比较两种DNA提取的方法（见表1）。在提取DNA所用时间上都约用时1 h，无显著差异。试剂盒提取过程约9个步骤的间断操作，费用5～6元/样；本试验方法提取DNA需要6个步骤的间断操作，费用0.2～0.4元/样，过程相对简单，一般离心机就能满足需求。同时，该法提取DNA过程中，利用DNA在盐中的溶解度和温度对蛋白的变性作用提取，未使用有机溶剂。而该试剂盒未对试剂的主要成分进行说明，不能确定是否含有对环境有害的有机溶剂。

表1 两种方法提取样本DNA的步骤、仪器需求、所需时间、费用Table 1 The cost,time,requirements and steps of extracted DNA by two kinds of method

2.2 DNA样品纯度和浓度用核酸蛋白定量仪测定纯度和浓度，优质DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0。两种方法提取DNA测量结果如表2所示。DNA的OD260/OD280值都在1.7～2.0。浓度和纯度分别进行单因素方差分析，P值分别为0.000 01和0.028，差异显著（P＜0.05）。

该试验方法提取的DNA的OD260/OD280平均值为1.82，DNA纯度比试剂盒法好，差异显著（P＜0.05）。本试验方法与试剂盒法提取的DNA纯度和浓度上都存在优势。平均质量浓度差异显著是否和血液的需要量有关，有待进一步的研究。

2.3 DNA样品完整性两种方法提取鸡血液DNA分别随机选择4份，试剂盒分别标识1～4。本法提取分别标识5～8。采用1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察DNA条带并拍照。可见该法提取DNA电泳DNA分子量大于2 000 pb，带最为致密，无降解；与试剂盒法无差异（见图1）。

表2 两种方法提取样本DNA的浓度、纯度及血液需要量（n=12）Table 2 The concentration,purity and blood volume of extracted DNA by two kinds of method

图1 两种方法提取DNA琼脂糖电泳图Fig.1 DNA electrophoresis of two extraction methods

3 讨论

3.1 快速、高效、环保的鸡基因组DNA提取方法，对鸡分子选育技术的推广和应用有重要意义。目前，鸡血样DNA提取方法主要是有机溶剂法，盐溶有机溶剂分离法和一些商品试剂盒[8-9]。有机溶剂和盐溶有机溶剂分离法在提取DNA过程中使用有毒、有害的有机溶剂，限制了该方法的推广。试剂盒提取鸡血样DNA价格比较昂贵，主要应用在科学研究等少量样本。有研究者比较酚法和盐析法后，发现盐析法在羊血样DNA提取可以减少操作时，更好地保存DNA完整性[10]。本法利用DNA在盐中的溶解特性和蛋白质的热变特性提取DNA，在试验中利用SDS裂解作用，将细胞破碎，高盐浓度下DNA与蛋白质的溶解度不同，使用加热方法，使基因组DNA与组蛋白分离，最后离心取上清液，通过乙醇沉淀，即可获得基因组DNA。相比试剂盒法，费用只占其4%，极大地节约了成本；简化了提取DNA步骤，使用的设备简单，无有机溶剂。在大量样本提取时，费用少、设备简单、提取过程健康无有机溶剂污染的特点，使得方法具有突出的优势。

3.2 DNA的纯度和浓度是关系到下游试验如PCR、酶切等的质量。本法提取的DNA无降解，与试剂盒提取的方法相比较，差异不大。在提取的浓度和纯度方面都优于试剂盒提取的DNA，不会影响下游试验。有研究者研究酚-氯仿法，盐析有机溶剂析出和试剂法，也发现试剂盒法在提取鸡抗凝血DNA在浓度和纯度上的不足[8]。不同动物的血样在提取DNA的方法和试剂上要求不同，这可能是试剂盒提取的鸡血样DNA在浓度和纯度存在差异的原因。

3.3 提取的DNA样品完整性，在后续的研究中起到重要的作用。该放法提取的DNA分子量大于2 000 pb，无降解，完全满足对DNA研究的完整性要求。

3.4 在分子辅助检测选育过程中，家畜基因组选择改良上[9]，大批量样本的DNA提取检测时，DNA提取和PCR检测成功率非常重要。有研究发现不同方法提取的DNA的提取成功率和下游试验的成功率都存在差异。研究发现酚-氯仿法、试剂盒法和盐溶有机溶剂分离法等DNA提取成功率分别为92.7%、95.8%和99.1%；PCR检测成功率分别为92.1%、95.6%和98.2%[8]。发现提取DNA的过程中，使用有机溶剂越多，DNA提取、PCR检测的成功率越低。这可能和提取过程中有机溶剂在DNA中残留有关。本法提取DNA（未使用有机溶剂），一次提取成功率为99%（462/466），一次检测成功率99%（458/462）（数据未发表）。该法提取的DNA在纯度、浓度和DNA完整性等方法都达到甚至高于试剂盒。

综合来看，本法提取DNA是一种环保、简洁适合鸡血液基因组DNA提取的方法，适合大批量样本的DNA提取，满足鸡的分子育种、分子辅助选育过程中对DNA的要求。