王子薇，刘英博，于 洋，李敬双，谭 超，吕疆蕾，孙媛媛，郑荣美，屈 影

（锦州医科大学，辽宁 锦州 121001）

白藜芦醇是非黄酮类化合物，1940年，Tokaoka首次从毛叶藜芦（Veratrum grandiflorum）的根部分离得到[1]，现在白藜芦醇已在72种植物中被发现，如虎杖、葡萄科属等。白藜芦醇主要存在于花生、葡萄、桑树和虎杖等植物中，其作为一种植物产生的抗毒素，可以抵抗外界病原体的入侵[2]。近年研究发现，白藜芦醇具有抗炎、抗癌、抗衰老、提高免疫力、保护血管内皮、保护神经系统等作用[3-4]。冯永红等[5]在低剂量白藜芦醇增强小鼠免疫反应研究中，发现白藜芦醇能促进小鼠T淋巴细胞增殖和IL-12的产生。Lee等[6]研究发现白藜芦醇能抑制金黄色葡萄球菌。虽然研究发现白藜芦醇具有一定增强免疫的作用，但在兽医临床上，白藜芦醇的免疫增强活性少有报道。本研究通过体外分离小鼠脾淋巴细胞，ELISA法检测白藜芦醇对淋巴细胞分泌细胞因子的影响，探讨白藜芦醇的免疫调节活性，为白藜芦醇的开发和利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 8周龄健康SPF级Balb/c小鼠，体重20±2 g，购于锦州医科大学。

1.1.2 药品和主要试剂 白藜芦醇购于曼斯特生物公司，RPMI-1640培养基和二甲基亚砜（DMSO）购于Solarbio公司，IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ试剂盒购于博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 脾淋巴细胞悬液制备 小鼠颈椎脱臼法处死，浸泡于75%酒精消毒约3 min，在超净台内剪开小鼠腹壁，取出脾置于盛有磷酸盐缓冲（PBS）的培养皿中，反复冲洗2次后置于RPMI-1640培养基中，用5 mL注射器抽取培养基吹打，重复上述操作直至脾外膜透明。将细胞悬液收集于离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入3 mL Tris-NH4Cl，吹匀，静置5 min，离心，重复上述操作直至红细胞全部裂解。细胞沉淀用RPMI-1640完全培养基悬起，台盼蓝染色，细胞计数板计数，活细胞数达到95%以上。调整细胞密度为5×106个/mL，制成脾淋巴细胞悬液[7-9]。

1.2.2 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响用24孔培养板，每孔1 mL脾淋巴细胞悬液，设空白对照组、阳性对照组和白藜芦醇不同浓度组，每组均设3复孔。空白对照组加1 mL RPMI-1640完全培养基，阳性对照组加1 mL左旋咪唑溶液（终浓度为20 μg/mL），白藜芦醇不同浓度组每孔分别加入1 mL含不同浓度的白藜芦醇（使其终浓度分别为10、20、40和80 μg/mL）溶液，将24孔培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养42 h，1 500 r/min离心5 min，收集上清于试管中。按ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪于570 nm处检测待测孔的OD值。根据标准品OD值绘制标准曲线，通过标准曲线计算IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ浓度[10-11]。

1.2.3 统计学处理 数据用平均数±标准差表示，用统计软件SPSS 17.0进行一维方差分析组间差异显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-3的影响根据标准品浓度和OD值绘制IL-3标准曲线，y=0.0137x，R2=0.955。白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-3的影响见表1。

白藜芦醇各浓度组与空白对照组比较：白藜芦醇各浓度组IL-3的分泌均极显著高于空白对照组（P＜0.01），表明白藜芦醇能够刺激淋巴细胞IL-3的分泌。

表1 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-3的影响Table 1 Effects of resveratrol on the secretion of IL-3 by spleen lymphocytes

白藜芦醇各浓度组与阳性对照组比较：20 μg/mL白藜芦醇组IL-3的分泌显著高于阳性对照组（P＜0.05），表明白藜芦醇对刺激淋巴细胞IL-3的分泌作用的有效性。

白藜芦醇各浓度组之间比较：20 μg/mL白藜芦醇组IL-3的分泌极显著高于其他浓度组（P＜0.01），随着白藜芦醇浓度增大IL-3分泌增多，在白藜芦醇为20 μg/mL时IL-3分泌量达到最高，随着白藜芦醇浓度增大IL-3分泌量达到最低，呈双向调节。

2.2 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-4的影响根据标准品浓度和OD值绘制IL-4标准曲线，y=0.004x，R2=0.952。白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-4的影响见表2。

白藜芦醇各浓度组与空白对照组比较：白藜芦醇各浓度组IL-4的分泌均极显著高于空白对照组（P＜0.01），表明白藜芦醇能够刺激淋巴细胞IL-4的分泌。

白藜芦醇各浓度组与阳性对照组比较：10 μg/mL白藜芦醇组IL-4的分泌低于阳性对照组（无统计学意义，P＞0.05），20 μg/mL白藜芦醇组IL-4的分泌高于阳性对照组（无统计学意义，P＞0.05），表明白藜芦醇对刺激淋巴细胞IL-4的分泌作用的有效性。

表2 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-4的影响Table 2 Effects of resveratrol on the secretion of IL-4 by spleen lymphocytes

白藜芦醇各浓度组之间比较：20 μg/mL白藜芦醇组IL-4的分泌极显著高于其他浓度组（P＜0.01），随着白藜芦醇浓度增大IL-4分泌增多，在白藜芦醇为20 μg/mL时IL-4分泌量达到最高，随着白藜芦醇浓度增大IL-3分泌量达到最低，呈双向调节。

2.3 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-12的影响根据标准品浓度和OD值绘制IL-12标准曲线，y=0.009x，R2=0.964。白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-12的影响见表3。

表3 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-12的影响Table 3 Effects of resveratrol on the secretion of IL-12 by spleen lymphocytes

白藜芦醇各浓度组与空白对照组比较：白藜芦醇各浓度组IL-12的分泌均极显著高于空白对照组（P＜0.01），表明白藜芦醇能够刺激淋巴细胞IL-12的分泌。

白藜芦醇各浓度组与阳性对照组比较：10 μg/mL白藜芦醇组IL-12的分泌低于阳性对照组（无统计学意义，P＞0.05），20 μg/mL白藜芦醇组IL-12的分泌高于阳性对照组（无统计学意义，P＞0.05），表明白藜芦醇对刺激淋巴细胞IL-4的分泌作用的有效性。

白藜芦醇各浓度组之间比较：20 μg/mL白藜芦醇组IL-12的分泌极显著高于其他浓度组（P＜0.01），随着白藜芦醇浓度增大IL-12分泌增多，在白藜芦醇为20 μg/mL时IL-12分泌量达到最高，随着白藜芦醇浓度增大IL-12分泌量达到最低，呈双向调节。

2.4 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IFN-γ的影响根据标准品浓度和OD值绘制IFN-γ标准曲线，y=0.0008x，R2=0.950。白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IFN-γ的影响见表4。

表4 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IFN-γ的影响Table 4 Effects of resveratrol on the secretion of IFN-γ by spleen lymphocytes

白藜芦醇各浓度组与空白对照组比较：白藜芦醇各浓度组IFN-γ的分泌均极显著高于空白对照组（P＜0.01），表明白藜芦醇能够刺激淋巴细胞IFN-γ的分泌。

白藜芦醇各浓度组与阳性对照组比较：10、40 μg/mL白藜芦醇组IFN-γ的分泌低于阳性对照组（无统计学意义，P＞0.05），20 μg/mL白藜芦醇组IFN-γ的分泌高于阳性对照组（无统计学意义，P＞0.05），表明白藜芦醇对刺激淋巴细胞IL-4的分泌作用的有效性。

白藜芦醇各浓度组之间比较：20 μg/mL白藜芦醇组IFN-γ的分泌极显著高于其他浓度组（P＜0.01），随着白藜芦醇浓度增大IFN-γ分泌增多，在白藜芦醇为20 μg/mL时IFN-γ分泌量达到最高，随着白藜芦醇浓度增大IFN-γ分泌量达到最低，呈双向调节。

3 讨论

细胞因子是调节机体免疫应答重要的蛋白分子，由活化的免疫细胞分泌。细胞因子分泌量多少可直接反映机体的免疫状况。CD4+T细胞分为Th1型和Th2型细胞，IL-12和IFN-γ主要由Th1细胞分泌，IL-3和IL-4主要由Th2细胞分泌。IL-3由活化的T细胞产生，是机体反应产生的抗炎性细胞因子，IL-4是受体α链和共同的g链之一组合的异质二聚体，是一种重要的抗炎性细胞因子，具有免疫调节作用[12]。IL-12主要由免疫活性细胞分泌，具有调控细胞免疫功能，增强免疫效应细胞的细胞活性等作用[13-15]。IFN-γ又称Ⅱ型干扰素或免疫干扰素，主要由T细胞、自然杀伤细胞等淋巴细胞分泌产生，可以诱导Th1型细胞的免疫应答，具有免疫调节作用[16-17]。雷宇鹏等[18]发现白藜芦醇能诱导巨噬细胞IL-12的分泌。曹喆燚等[19]发现红酒中白藜芦醇能促进淋巴细胞分泌IFN-γ。上述文献报道白藜芦醇对巨噬细胞和淋巴细胞分泌细胞因子分泌的影响都从单一细胞因子进行研究，本试验检测白藜芦醇对淋巴细胞分泌IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ等多种细胞因子的影响，发现白藜芦醇能诱导淋巴细胞分泌IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ。提示白藜芦醇通过激活静止的T淋巴细胞，使其活化，免疫活性增强，T淋巴细胞只有受到抗原或有丝分裂原的刺激后才会合成和分泌细胞因子，由于Th1型细胞因子介导细胞免疫反应，Th2型细胞因子介导体液免疫反应，白藜芦醇能够同时促进Th1型和Th2型细胞因子分泌，本试验结果与已报道的试验结果一致的，白藜芦醇能通过调节细胞免疫反应与体液免疫反应，从而发挥免疫增强的作用。

4 结论

白藜芦醇能诱导脾淋巴细胞IL-3、IL-4、IL-12和IFN-γ细胞因子的分泌，从而提高淋巴细胞的免疫功能。