王捷夫，王茜

细胞内蛋白质的表达水平受制于一系列程序的精密调控，其中一个重要环节就是翻译后修饰水平的调节［1-2］。目前已经发现很多调控翻译后修饰的蛋白在癌症组织中异常表达，而这些蛋白质中很多成员已经成为癌症治疗的靶向分子［2-5］。其中去泛素化酶9X（ubiquitin specific protease 9X，USP9X）是十分具有代表性的成员之一，位列前500位“最低耐受性”变异的人类基因之一［6］，近年来也成为国内外的研究热点。本文旨在对常见的消化系统恶性肿瘤的病理过程中USP9X发挥的作用进行论述和分析。

1 蛋白质泛素化和去泛素化酶

泛素化（ubiquitination）和去泛素化（deubiquitination）是细胞蛋白质翻译后修饰的2 个重要调节方式。作为一种重要的蛋白质修饰形式，蛋白质泛素化在调控蛋白质稳定性方面起着重要作用［1-2］。泛素蛋白是一个由76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，其能在泛素激活酶（ubiquitinactivating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitinconjugating enzyme，E2）和泛素连接酶（ubiquitin ligase，E3）等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的1 个或多个赖氨酸残基发生共价连接［7］。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链；如果多泛素蛋白链通过第48位赖氨酸残基相连，靶蛋白会进入蛋白酶体而被降解［7］。

与乙酰化、磷酸化修饰类似，泛素化修饰也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）将泛素蛋白修饰物去除掉［2，8］。目前研究证实，细胞内广泛存在多种去泛素化酶，这些不同类型的去泛素化酶均能水解底物蛋白上的泛素链之间的链接，对蛋白降解进行反向调节，从而影响蛋白质的功能［2］。去泛素化酶可以影响或调节细胞的生长发育、神经病变以及肿瘤发生等细胞生理或病理过程［2，9-10］。人类基因组能够编码近百种去泛素化酶。泛素特异性蛋白酶家族（ubiquitin specific proteases，USPs）是目前已知的去泛素化酶中成员最多、结构最具多样性的一类去泛素化酶，亦属于半胱氨酸蛋白酶类［11］。这些分子都含有1个泛素水解酶结构域，2个短而保守的片段，即赖氨酸盒和组氨酸盒，序列中具有起催化作用的三联残基，即半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺，能将泛素分子从大的蛋白上移除［2，10］。近年来，去泛素化酶因对细胞周期调控、DNA 修复、染色质重塑等多种生物学过程的调节以及肿瘤发生过程中经常改变的信号转导通路具有深远的影响而受到广泛关注。

2 USP9X概述

USP9X 是去泛素化酶的重要成员之一，其长度超过2 550个氨基酸，但目前对其蛋白质结构知之甚少。除了典型的半胱氨酸和组氨酸盒催化序列外，唯一可识别的结构域是N端末端的泛素样的结构域（ubiquitin-like domain，UBL）。进化上，从果蝇到哺乳动物的USP9X蛋白序列显示出显著的保守性，而不同物种间序列的保守性反映了其在物种间的重要功能。USP9X同源物最先发现于果蝇的诱变筛选过程的脂肪基因faf，并被证明是合胞期胚胎发育和光受体命运测定的必需基因［5］。小鼠中Usp9x 的表达挽救了faf突变体所导致的眼睛和胚胎缺陷，进一步体现了从昆虫到哺乳动物体内USP9X 的功能保守性。此外，在Usp9x 条件缺失性小鼠中表达人源USP9X 能够去除神经元轴突的功能异常和迁移障碍。机制上，USP9X 可以从底物和包括 K48、K63 和K29在内的多种泛素链上裂解单泛素［12-13］。

近年来研究显示，USP9X 可以通过稳定不同的底物影响不同生物学过程，如蛋白质运输［14］、细胞凋亡［15］、极化［16］、自噬［17-18］、细胞生长及迁移［19-20］、免疫应答［21-22］和干细胞的自我更新及分化［23-24］。USP9X还能参与多条信号通路：USP9X是转化生长因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）信号通路的重要组成部分；Smad4的519位赖氨酸单泛素化过程会阻碍Smad4 转录活性，而USP9X 能够去除这一位点的泛素化；USP9X 能够参与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的调控；USP9X 通过阻止活化的凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）的降解介导 ASK1 信号通路激活［25］。USP9X 在细胞内的定位也不尽相同，取决于细胞类型和细胞状态。USP9X 一般存在于胞质和与膜相互作用的凹陷中［12-13，26］，也有研究发现其还能定位于特定结构，如高尔基体、核内体、线粒体，甚至能进入核内［27］。功能上，USP9X 基因变异与神经系统疾病有关。目前已报道USP9X在各种疾病，包括多种癌症中异常表达：在低度浆液性卵巢肿瘤中，USP9X被鉴定为致癌候选基因之一［28］；在前列腺癌中，USP9X能够稳定转录因子E-26 相关基因（E-twenty-six related gene，ERG），促进前列腺癌进展［29］；食管鳞癌和多发性骨髓瘤中USP9X 的高表达与肿瘤进展和预后不良有关［30-31］；在口腔鳞状细胞癌中也发现了USP9X 的突变［32-33］；而在脑癌中，USP9X表达水平的降低抑制了脑肿瘤细胞的生存能力，提示USP9X在脑肿瘤中起致癌作用［34］。这些证据表明USP9X 可能发挥了促进癌症进展的功能。然而，也有学者报道，USP9X在胰腺癌中通过限制鼠类肉瘤病毒癌基因K-ras癌基因（Kirsten-ras Proto-oncogene）诱导的细胞转化从而抑制肿瘤侵袭性，与抑制癌症有关［35］。可见根据癌症的类型和分期不同，USP9X 在肿瘤中扮演的角色也不尽相同。

3 USP9X在消化系统肿瘤中的作用

3.1 USP9X 在食管癌中的作用 食管癌是第八大最常见的癌症类型，在世界范围内癌症相关死亡率排名第6 位。食管癌的发病率在国际上各不相同，其中东亚及非洲的发病率最高。食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，农村发病率高于城市，且有一定的区域聚集性。近年来在我国整体发病率呈下降趋势［36］。

Peng 等［30］收集了 102 对来自低度上皮内瘤变、高度上皮内瘤变和浸润性食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者的正常及病变组织样本，通过免疫组织化学染色发现食管从正常上皮、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变到浸润性食管鳞状细胞癌中USP9X 表达水平逐步增加，且最密集着色通常发生在食管上皮的基底层和前体病变的下棘层，提示该处最易发生恶变。USP9X的表达水平与浸润深度和淋巴结转移呈正相关，同时ESCC 患者USP9X 表达水平升高与生存率下降显著相关；USP9X 表达上调在ESCC 癌前病变的形成和发展中起着重要作用，其表达水平与ESCC患者的生存密切相关，因此可作为ESCC的潜在生物标志物和预后预测因子。

3.2 USP9X 在胃癌中的作用 胃癌（gastric carcinoma，GCC）是全球最常见的癌症之一，是癌症相关死亡的第二大原因［37］。我国胃癌的发病率和死亡率均处于各种恶性肿瘤的前列［36］。多数患者就诊时，肿瘤已处于Ⅲ期、Ⅳ期，虽经积极综合治疗，远期疗效仍令人沮丧。Fu 等［38］收集了 68例胃癌患者的正常组织与癌组织。通过免疫组化、免疫印迹等方法检测了不同组织中USP9X 和Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）的表达，发现USP9X在胃癌组织中的表达显著高于正常对照组织；胃癌组织中USP9X表达与Mcl-1 表达呈正相关，与淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期呈显著正相关，提示其作为癌基因的潜在意义，并且与较差的存活率显著相关。为了解释这一现象，利用USP9X 小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）转染胃癌 AGS 细胞阻碍 USP9X 的表达，能够显著诱导胃癌细胞凋亡，并降低胃癌细胞的侵袭能力，提示USP9X可能是胃癌细胞凋亡和侵袭的关键调控因子［39］。

3.3 USP9X 在结直肠癌中的作用 结直肠癌在经济发达地区和国家十分常见，一般为第2～4 位常见癌症。随着经济的发展，生活方式发生改变，特别是饮食结构的改变，近年来发展中国家结直肠癌的发病率正在迅速上升［36］。

Peddaboina 等［40］通过对结肠癌样本进行分析后发现，USP9X作为Mcl-1的去泛素化酶，与Mcl-1和B淋巴细胞瘤-xL（B-cell lymphoma-extra large，BclxL）在多数结肠肿瘤样本中高表达并且共存，而Mcl-1和Bcl-xL的表达水平与临床分期相关。体外实验表明USP9X 的抑制剂WP1130 能促进Mcl-1 降解，与ABT-737 联合应用显示出化疗的协同作用，促进多种结直肠肿瘤细胞的凋亡［31］。为了研究USP9X 在细胞应对抗癌药物中的影响，Harris 等［41］利用同源重组获得了USP9X基因座被破坏的癌细胞系，在一种广泛用于治疗结直肠恶性肿瘤的化疗药物——5-氟尿嘧啶的作用下，发现USP9X缺陷的癌细胞凋亡明显增加，生存率显著下降，提示降低USP9X表达可能增加癌症细胞对某些常规治疗药物的敏感性。为了解结肠癌中USP9X 基因是否存在突变，Jo等［42］在79例结肠癌样本中采用聚合酶链反应（PCR）和单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）方法检测外显子，发现USP9X 编码序列单核苷酸重复序列A7 的移码突变可能造成微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）的结直肠癌。

与之相反，Khan等［43］发现USP9X能够抑制结肠肿瘤的形成。该研究采用蛋白质组学鉴定出USP9X可以与F-Box 和WD 重复域蛋白7（F-Box And WD Repeat Domain Containing 7，FBW7）相互作用并去除其泛素化，因此USP9X缺失将导致FBW7不稳定；肠内缺乏Usp9x 的小鼠出现了分泌细胞分化减少，祖细胞增殖增加，与Fbw7表型相反；此外，USP9X失活将损害肠再生，并增加结肠炎相关性肠癌的肿瘤风险。因此该研究认为，USP9X通过调节Fbw7蛋白的稳定性来抑制肿瘤的形成。

3.4 USP9X 在肝癌中的作用 当前肝癌发病率我国居世界第1位，我国癌症死因中肝癌居第2位。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占所有原发性肝癌的90%以上［36］。

有研究报道长链非编码RNA（long noncodingRNA，lncRNA）LINC00473（LNC473）能够参与肝肿瘤的进展。Chen 等［44］研究发现，LNC473 在肝癌组织中表达显著升高，并且与较大的肿瘤体积、较高的BCLC 分期、血管浸润和预后不良相关。LNC473可通过募集USP9X抑制生存素（Survivin）的泛素化，增加Survivin 的表达，从而促进肝癌细胞增殖和侵袭，并诱导上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）过程。另一研究结果表明，USP9X 在肝癌细胞 SMMC7721 和 HepG2 中表达上调，而抑制USP9X 表达后，Mcl-1 蛋白表达下降，诱导肝癌细胞凋亡，肝癌细胞的生长和迁移受到显著抑制，因此，USP9X可能是肝癌治疗和早期检测的潜在靶点［45］。Liu等［46］研究发现，相较于抑癌基因p53表达缺失的肝癌细胞系Hep3B，具有p53表达的Huh7、HepG2 和SNU387 细胞系对传统化疗药阿霉素和WP1130 联合治疗表现出更强的细胞增殖抑制，而 WP1130 正是通过抑制 USP9X 增强 HCC 细胞对阿霉素的化疗敏感性。这个过程可能是通过抑制USP9X 从而加速了p53 降解，在肺癌中也有相似结果［47］。此外，USP9X 能够通过 ASK1 促进肝癌细胞死亡。肝癌细胞系中糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）能够通过抑制USP9X活性，增强ASK1 通过蛋白酶体途径降解，最终抑制活性氧诱导的肝癌细胞死亡［48］。

3.5 USP9X 在胰腺癌中的作用 胰腺癌早期诊断困难，大多数患者在确诊时已属中、晚期，常常失去了手术根治机会，手术切除率一般在30%左右。即便是能手术切除的患者，其5年生存率也大约不到10%；至于未切除者，多数在半年内死亡，故该病的预后极差［36］。

在正常胰腺腺泡细胞中，USP9X 可以在影响自噬的促生存途径中发挥作用。膜泡蛋白VMP1-USP9X-p62（Vacuole membrane protein-1）介导的噬菌作用是一种新型选择性自噬途径，可防止胰腺细胞死亡［17］。但在胰腺癌中，USP9X 的作用却不甚明晰。一些研究者认为USP9X 能够阻碍胰腺癌的进展：Pérez-Mancera 等［35］利用Sleeping Beauty（SB）转座介导的插入突变在小鼠胰腺癌癌前病变模型中寻找与致癌基因K-ras（G12D）协同作用、加速肿瘤发生和进展的基因，筛选出包括USP9X在内的多个胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的新候选基因。USP9X的缺失可以保护胰腺癌细胞免于失巢，并与Kras（G12D）协同作用，加速小鼠胰腺肿瘤的发生。该研究通过分析100例澳大利亚患者、42例美国患者及404例德国患者的PDA标本及其临床数据，发现USP9X低表达与患者不良预后、低生存率呈正相关，与广泛转移呈负相关；此外，用曲古菌素A或5-氮杂-2'-脱氧胞苷可提高人PDAC 细胞系 USP9X 的表达，提示 USP9X 是 PDAC中具有预后和治疗相关性的主要肿瘤抑制基因。Zhu等［49］报道在胰腺癌细胞株MIA PaCa-2、CFPAC-1、BxPC-3 和 AsPC-1 中，USP9X 能够去除 Hippo 通路中大抑癌基因激酶2（Large tumor suppressor kinase 2，LATS2）上的泛素，而USP9X 的缺失激活了Yes 相关蛋白 1（Yes-associated protein，YAP），从而增强了细胞的致癌潜能。但另一方面，也有部分研究表明，USP9X 在PDAC 进程中充当致癌基因的角色：通过应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase，SP）检测30例老年患者手术切除的原发性胰腺癌组织及癌旁非肿瘤胰腺组织中USP9X的表达，发现胰腺癌组织中USP9X 表达显著上升，并与有无淋巴结转移及TNM分期显著相关［50］。任泽强等［51］研究发现，在胰腺癌的发生、发展中，USP9X 能够抑制Survivin 降解，Survivin 与USP9X 协同促进了胰腺癌的发生、发展，Survivin、USP9X 高表达的胰腺癌组织恶性程度更高，预后更差，此结果与其他研究者报道的在HCC中所得结果类似［44］。Liu 等［52］采用免疫组织化学染色法分析不同病理分级胰腺癌组织中USP9X 的表达。USP9X在胰腺癌组织中的表达显著高于在邻近的非肿瘤组织中的表达。下调内源性USP9X 表达可明显抑制PANC-1 细胞的迁移和侵袭，促进细胞凋亡，并上调上皮标记物E-cadherin 的表达，下调Snail、Twist、N-cadherin、vimentin 等间质标记物和底物Survivin的表达水平。因此，USP9X可能通过促进EMT，促进PANC-1细胞的迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，提示其在PDAC 的治疗和预后中的重要潜在作用。

为了解释USP9X 在PDAC 中作用的相互矛盾，Pal 等［53］利用建立的人胰腺肿瘤细胞系（PANC1 和MIAPACA2）和4个自发永生化的人胰腺患者源肿瘤（Patient-derived tumor Xenograft，PDX）细胞系进行了功能研究。USP9X 的过表达增加了PANC1 细胞的3D 生长和侵袭，并上调了已知的USP9X 底物Mcl-1 和瘙痒蛋白Itch（亦称atrophin-1 interacting protein 4，AIP）的表达。在2D和3D培养中评价小分子去泛素酶抑制剂G9 对USP9X 活性的抑制作用发现，通过短发卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲除或 G9 处理抑制 USP9X 可降低 Mcl-1 和 Itch 蛋白水平，减少PANC1和PDX细胞系的3D集落形成，诱导MIAPACA2细胞快速凋亡。但在由胰腺肿瘤模型的基因工程小鼠胰腺癌细胞系中，G9不能影响细胞3D生长，对小鼠体内异位种植的肿瘤生长亦无明显影响。Cox 等［54］通过在 5 个 PDAC 细胞系（BxPC3、Capan1、CD18、Hs766T 和 S2-013）中降低 USP9X 的表达，发现细胞锚定依赖型生长受到抑制。而在BxPC3 和 Capan1 细胞中，USP9X 还能够影响细胞非锚定依赖型生长。此外，USP9X 还能改变部分细胞的细胞周期分布及侵袭能力。利用USP9X 抑制剂WP1130 都能够显著地诱导这些细胞的细胞毒性。该研究认为，USP9X 的功能和作用高度依赖于周围环境。因此，USP9X 可能是治疗晚期PDAC 的一个有前途的治疗靶点。

为了进一步明确USP9X 能否作为肿瘤治疗中的靶点，Ma等［55］研究了体外胰腺细胞系和小鼠异种移植模型，在探究USP9X在吉西他滨耐药中作用时发现，USP9X 在胰腺癌细胞中的表达与吉西他滨耐药呈正相关，而去泛素化酶抑制剂WP1130 对USP9X的作用使胰腺癌细胞对吉西他滨敏感。抑制剂WP1130 抑制了吉西他滨诱导的自噬作用，而阻断自噬作用则消除了WP1130对胰腺癌细胞吉西他滨的致敏作用。因此，吉西他滨和WP1130 联合治疗通过抑制体内自噬增强吉西他滨的抗肿瘤作用，为胰腺癌中吉西他滨的耐药性提供了新的认识。

4 结语

USP9X 的异常表达对于肿瘤的形成、发展有着重要的作用，且其表达水平与肿瘤临床及病理特征的密切关联，与肿瘤患者的预后紧密相关，临床上也许可以通过对USP9X 蛋白表达水平的检测来评估肿瘤患者的预后或指导进一步治疗。然而也要清楚地认识到，在体外培养细胞中，USP9X既可能促进细胞凋亡，又可以促进细胞存活，这与其在不同种类、状态中的细胞或肿瘤中相互作用或占优势的底物有着密不可分的联系，因此对于理解其在癌症中的潜在作用有着复杂的可能性。