何方, 师希雄＊,岳建伟,余群力，王鹏燕,高振艳,陈颢予,岳瑶

甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070

引言

牦牛是以青藏高原为中心，毗邻高山、亚高山高寒地区的特有畜种，我国是世界上牦牛数量和品种最多的国家[1-2]。牦牛肉不仅蛋白质与氨基酸含量高，脂肪含量低, 而且无农药残留[3]，是一种天然的绿色食品，但与其他肉类相比，嫩度较差[4]。目前，国内外研究表明，宰后成熟过程中肉的嫩化主要归结于肌原纤维蛋白的降解[5-6]，所以肌原纤维蛋白与肉的嫩度紧密相关。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇，包括超氧自由基(O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(-OH)等[7]。线粒体电子传递链是活性氧产生的最主要来源[8]，活性氧一方面通过修饰蛋白质骨架肽链及氨基酸的侧链来改变蛋白的交联或降解状况，影响蛋白质的溶解性、疏水性、持水力、凝胶特性等理化性质，进一步决定着肉的质构、风味、色泽等消费品质以及蛋白质的组成、体外消化率等营养品质。另一方面，ROS也可以间接介导蛋白质氧化，主要是通过介导脂质过氧化和加速非酶糖基化生成活性羰基化合类物质，使蛋白质糖基化和蛋白质-蛋白质的交联，再利用其活性中间产物间接介导蛋白质氧化，使正常蛋白的活性增强或减弱[9]，因此，ROS可能影响宰后肉成熟过程中肌原纤维蛋白的降解。目前关于蛋白质氧化在肉品加工领域颇具争论，Sumder[10]认为活性氧在肉的成熟过程中会促进肌原纤维降解，增加肉的嫩度，张玉林[9]认为活性氧在肉的成熟过程中会抑制肌原纤维降解，不利于肉的嫩化。ROS对细胞凋亡酶还有一定作用，Caspase本身是以非活化的状态存在，但是当有ATP产生时会首先活化起始酶，通过级联反应激活效应酶[11]，细胞凋亡酶系中Caspase-9和Caspase-3分别属于起始酶和效应酶，效应酶Caspase-3作用于肌原纤维蛋白，使肌原纤维降解，达到嫩化的目的[12]。总之，ROS对肌原纤维蛋白的影响报道不一致，而且关于牦牛肉的研究鲜有报道。因此，有必要深入研究牦牛肉宰后成熟过程中ROS细胞凋亡酶活性及肌原纤维蛋白的影响，为牦牛肉成熟工艺的改进提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

甘南牦牛，甘肃清河源清真食品股份有限公司，随机选取5头自然放牧，健康无病36月龄的牦牛，采用伊斯兰教屠宰方式屠宰后，立即从半胴体上取背最长肌(Longissimus Dorsi，LD)

1.1.2 试剂

30%的过氧化氢（H2O2）、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）、氯化钠（NaCl）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、蔗糖、磷酸钠（Na3PO4）、氯化镁（MgCl2）、五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、氢氧化钠（NaOH）、酒石酸钾钠、氯化钾（KCl）、磷酸钾（K3PO4）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化氢（HCl）、叠氮化钠（NaN3）等均为国产分析纯，活性氧荧光探针DCFH-DA（美国sigma公司）、caspase-3/-9检测试剂盒（北京索莱宝公司）

1.1.3 仪器

XHF-D高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、TGL-24MC高速冷冻离心机（湖南平凡科技有限公司）、SP-756P型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、FTIR-650型傅里叶变换红外光谱仪（天津港东科技发展股份有限公司）

1.2 样品处理

将取下的背最长肌，快速取约100g肉样放入液氮中作为0h样品。其余肉样迅速切成体积均匀的肉块（约50 g/块），随机分成两组，第一组不做任何处理，第二组样品浸泡于10mmol H2O2溶液（肉样：处理液=10∶1），两组样品分别置于0～4℃条件成熟0、6、12、24、72、120、168 h，将肉样在设计时间点采集并用液氮迅速冷冻后置于-80℃冻藏，用于测定Caspase-3活性、Caspase-9活性、肌原纤维蛋白溶解性、MFI、可溶性蛋白含量的测定等指标。

1.2.1 ROS相对含量的测定

ROS相对含量的测定参考Lee等[13]与张玉林等[9]的方法稍加改进：将2g不带肌腱、脂肪的肉放入12mL的Tri-HCl缓冲液（10 mmol/L Tri-HCl，0.8%(m/V) NaCl，0.1mmol/L EDTA-2Na，10 mmol/L sucrose，pH 7.4）中剪碎，在冰浴中匀浆1min，3000g冷冻离心15min收集上清，采用双缩脲法测定上清蛋白浓度，并取将上清液与反应缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，0.8%(m/V) NaCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10mmol/L sucrose，10 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4）按1∶1的比例混合，孵育（37℃，15min）后4℃，12000 g条件下离心8 min，并迅速用荧光分光光度分别计测定（激发波长488 nm，发射波长525 nm）荧光值。

1.2.2 Caspase-3、9活性的测定

按照Caspase-3和Caspase-9活性试剂盒上的测定方法测定。

1.2.3 肌原纤维蛋白溶解性

肌原纤维蛋白的提取：肌原纤维蛋白的提取方法参考王宇[14]的方法并进行适当的改进。肌原纤维蛋白的提取在4℃下进行，取2g绞碎的肉样品加入8ml缓冲液（10 mmol/L Na3PO4，0.1mol/LNaCl，2mmol/LMgCl2和1mmol/L EDTA，pH 7.0），匀浆60s后，在4℃下6000r/min离心15min，取沉淀重复上述步骤2次，得到粗提肌原纤维蛋白。取此沉淀加入4倍体积的0.1mol/L NaCl溶液，匀浆60s，6000r/min冷冻（4℃）离心15min，重复此操作1遍，取此沉淀加入4倍体积的0.1mol/L NaCl溶液，匀浆60s，4层纱布过滤，取滤液，用0.1mol/L盐酸调节pH至6.0，6000r/min冷冻（4℃）离心15min，沉淀即为提纯的肌原纤维蛋白，4℃冷藏备用。

溶解性的测定在kingsley等[15]的方法上做了一些调整，肌原纤维蛋白1g，溶于50mL浓度为0.75%的NaCl溶液中，用0.1mol/L的氢氧化钠或0.1mol/L的盐酸调节pH至7.0（偏离等电点5.5即可），再在60℃水浴锅加热30min，之后6000r/min冷冻（4℃）离心15min取上清液，采用双缩脲法测定离心前后上清液中蛋白质含量，按下式计算：

肌原纤维蛋白溶解性（%）=上清液蛋白质含量/样品中总蛋白质含量× 100%

1.2.4 MFI

参照DelgadoE.F.等[16]的研究方法，取2g肉样，用20mL的MFI缓冲液（100mmol/L的KCl、20mmol/L Na3PO4、1mmol/L EDTA、1mmol/L MgCl2、1mmol/L NaN3，pH 7.1），将肉样机械冰浴匀浆后。所得悬浊液在1000g离心15min，弃去上清液，沉淀再用20mL的MFI缓冲液使之重新处于悬浊态，再于1000g离心15min，弃去上清液。沉淀用10mL的MFI缓冲液使之重新处于悬浊态，用200目尼龙筛网过滤该悬浊液，另用10 ml的MFI缓冲液帮助肌原纤维蛋白通过滤网，过滤所得的肌原纤维蛋白悬浊液用双缩脲法测定其蛋白含量。

计算：用缓冲液调整悬浮液调节肌原纤维蛋白液的最终浓度为0.5mg/ml（MFI缓冲液加入6ml，根据测得蛋白含量计算所需蛋白体积），再用分光光度计测定（540nm处）吸光值，将所得结果（吸光值）乘以200后即为MFI值。

1.2.5 肌原纤维蛋白质二级结构含量

参考孙圳等[17]的方法，取背最长肌，剔除可见脂肪和结缔组织，按样品（g）与提取液（0.1mol/L NaCl，10mmol/L Na3PO4，2mmol/L MgCl2，2mmol/L EGTA，pH 7.0）1∶4（W/V）的比例加入，于组织捣碎机中充分斩拌混匀，得到均匀的肉糜混合液；形成的肉浆离心（2000g，15min，4℃），取其沉淀；在相同条件再洗涤、继续离心两次，用纱布过滤除去肌膜及脂肪组织等；随后用4倍体积（V/W）的0.1mol/L NaCl溶液洗涤、离心两次（2000g，15min，4℃），得到肌原纤维蛋白，将其冷冻干燥后存于抗氧化剂及其干燥剂中，用傅里叶变换红外光谱仪测定二级结构并利用PeakFit 4.12软件拟合并计算各个二级结构百分比。

2.结果与分析

2.1 H2O2对牦牛肉成熟过程中ROS生成量的影响4.2 测试方法

图1 H2O2 对牦牛肉成熟过程中ROS生成量的影响（A、B代表在同一时间点两组之间差异显著）Figure 1 changes in relative content of ROS after natural maturity and H2O2 soaking during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

由图1可知，牦牛肉成熟过程中，随着成熟时间的延长，试验组与对照组ROS相对含量均呈现先下降再上升再下降的趋势，且对照组和试验组均在5d时达到最高值，但0.5-8d试验组ROS含量显著高于对照组（P＜0.05）。H2O2作为自由基的一员，可以调节细胞代谢[9]，本研究中H2O2组ROS相对含量明显高于对照组，这与张玉林等[9]研究结果类似。

2.2 ROS对牦牛肉成熟过程中 Caspase-3与Caspase-9活性的影响

图2 ROS对牦牛肉成熟过程中 Caspase-3/9活性的影响（A、B代表在同一时间点两组之间差异显著）Figure 2 Effect of ROS on caspase-3/9activity during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

由图2A可知，随着成熟时间的延长，0.5-3d试验组与对照组Caspase-3酶活性呈现先降低再升高再降低的趋势，0.5d时Caspase-3酶活性最低，3d时最高，且0.5-1d试验组高于对照组（P＜0.05）。由此可见，活性氧可提高Caspase-3的活性。由图2B可知，随着宰后成熟时间的延长，试验组与对照组Caspase-9活性先降低后升高再降低，0.5-1d 试验组Caspase-9活性显著高于对照组（P＜0.05）。这可能是ROS导致Caspase-3/9活性增大，激活细胞凋亡酶级联反应。宋昱庆等[18]研究发现低浓度的活性氧能够促进细胞凋亡的表达。本试验与上述试验结果都能够说明细胞凋亡酶系受到ROS的调控作用，并且ROS增加了Caspase-3/9的活性。

2.3 ROS对牦牛肉成熟过程中MFI的影响

图3 ROS对牦牛肉成熟过程中 MFI的影响（A、B代表在同一时间点两组之间差异显著）Figure 3 Effect of ROS on MFI of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

MFI（肌原纤维蛋白小片化指数）表征肌原纤维内部结构破坏的情况，可以反映肉的嫩化程度，MFI越大，表明肌原纤维内部结构受破坏的程度越大，肉的嫩度也越好。图3中0-8d 试验组与对照组的MFI均呈现呈上升的趋势，但0.5-8d 试验组MFI显著高于对照组（P＜0.05），可能是用H2O2处理后，ROS加强了肌原纤维蛋白的氧化作用，肌原纤维上连接Z线与I 带、A带的蛋白降解，导致Z线弱化，肌原纤维降解为数个肌节组成的串联体或片断[19]，表现为MFI上升，最终导致肉被嫰化。

2.4 ROS对牦牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白溶解性的影响

图4 ROS对牦牛肉成熟过程中肌原纤维溶解性的影响（A、B代表在同一时间点两组之间差异显著）Figure 4 Effect of ROS on the solubility of myofibrillar protein of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

肌原纤维蛋白是构成肌原纤维的蛋白质，也称不溶性蛋白质，占肌肉中总蛋白的40-60%，主要包括肌球蛋白，肌动蛋白，肌动球蛋白，原肌球蛋白和肌钙蛋白等。由图4可知随着成熟时间延长，试验组与对照组均呈现先下降再上升的趋势，且试验组均高于对照组（P＜0.05）。这可能由于 ROS加速蛋白质氧化的进程，使蛋白质理化性质发生改变，蛋白质溶解性增加。

2.5 ROS对蛋白质二级结构的影响

图5 ROS对牦牛肉成熟过程中Caspase-3/9活性的影响（A、B代表在同一时间点两组之间差异显著）Figure 5 Effect of ROS on protein secondary structure of yak during the postmortem ageing of yak(A, B represents a significant difference between the two groups at the same time point).

二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性的结构构象，主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲。通过改变蛋白质所处环境，其结构会发生改变从而导致功能的变化，其中凝胶性的改变包含了肌原纤维蛋白结构与功能的变化[20]。由图5可见试验组β-折叠在3d、5d、8d时显著高于对照组（P＜0.05），无规则卷曲在1-8d时显著高于对照组（P＜0.05），α-螺旋在0-8d时逐渐降低。本实验中二级结构最明显的变化是无规则卷曲的增加与β-转角的减少，Fang等[21]研究中发现α-螺旋并不是直接转化为β-折叠，中间需要α-螺旋转变为无规则卷曲的过程。张玉林等[9]也发现H2O2可促进蛋白氧化，从而促进止α-螺旋转化为无规卷曲和β-折叠，这与本试验结果一致。

3.结论

在牦牛肉宰后成熟过程中，H2O2促进ROS的产生，导致MFI升高、肌原纤维溶解性增加，Caspase-3和Caspase-9活性增强，说明ROS促进了细胞凋亡和肌原纤维蛋白的降解。同时，ROS 还影响脂肪族 C-H 基团的微环境，使肌原纤维蛋白质二级结构中α-螺旋、无规则卷曲升高，β-转角降低以及β-折叠的变化从而改变肌原纤维蛋白质的结构。总之，低浓度的H2O2促进ROS产生，进而增加细胞凋亡酶活性和促进肌原纤维蛋白的降解，使肉的嫩度增加。