张 雷， 冉 琴， 王 星， 李国平

哮喘是一种以可逆性气道阻塞和气道高反应(airway hyperresponsivenes，AHR)为特点的慢性炎症性疾病。全球有3.34亿人深受其害，哮喘患病率每年以1%的速度增加[1]，在儿童和青少年中尤为显著。空气动力直径<2.5 μm的颗粒物，也称为人肺可吸入颗粒物，对呼吸系统的危害极其严重，是造成烟雾污染并引起呼吸道疾病的主要污染物[2-3]。调查显示，北京的最高日平均PM 2.5浓度是500 μg/m3，高于世界卫生组织建议值的20倍[4]。PM 2.5的化学组成因地区及污染源的不同而差异较大，目前所知的主要组分包括：微生物成分如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、有机碳多环芳烃、微量元素、金属离子、无机盐等[5]。由于PM 2.5粒径小、在空气中滞留时间长，易避开气管细胞纤毛等过滤机制进入下呼吸道，故在哮喘病的发生和发展中起到重要作用。Zhou等研究发现，PM 2.5的暴露能诱导人气道上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)发生氧化应激、DNA链断裂及凋亡[6]。Zhang等研究发现，PM 2.5通过诱导激活内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和自噬，对斑马鱼的发育有严重毒害作用[7]。So等在哮喘模型中发现激活核因子(nuclear factor,NF)-κB信号通路能诱导ERS的发生，导致展开和(或)错误折叠蛋白质在ER的累积，干扰蛋白质合成和分泌，诱导活性氧生成，并增加炎症的发生[8]。ERS与哮喘炎症反应、氧化应激、黏液高分泌都有密切关系[9]。现有的研究显示，PM 2.5能够诱导ERS，促进炎症反应，对支气管上皮细胞造成损害。本研究拟采用OVA建立小鼠过敏性哮喘模型，模拟人类吸入PM 2.5的方式，探讨空气污染颗粒PM 2.5对哮喘小鼠ERS、炎症及AH的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 SPF级6～8周龄雌性C57BL/6J小鼠24只，体质量(20±2) g[重庆腾鑫科技公司，许可证号：SCXK(渝)2017-0001]。分笼饲养于恒温(23 ℃)恒湿(相对湿度50%～70%)的清洁级西南医科大学实验动物房中，12 h光照循环。

1.1.2试剂 卵清蛋白(ovalbumin，OVA，批号：326A0519，北京索莱宝科技有限公司);氢氧化铝[Al(OH)3，批号：20120901，成都科龙化学品有限公司];乙酰甲胆碱(methacholine,Mch，批号：108K1232，美国Sigma-Aldrich公司);RNA simple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒、RT SuperMix试剂盒和SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；IL-17和TNF-α引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成;Mouse IL-17 Elisa 试剂盒(HTLV171101，北京安迪华泰科技有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010，上海碧云天生物技术有限公司);β-actin鼠单克隆抗体(sc-130656，美国Santa Cruz公司);GRP78鼠多克隆抗体(批号：ab21685，美国Abcam公司);CHOP鼠多克隆抗体(批号：ab11419，美国Abcam公司);IRE1兔多克隆抗体(批号：ab37073，美国Abcam公司);磷酸化IRE1兔多克隆抗体(批号：ab48187，美国Abcam公司)。

1.1.3仪器 实时荧光定量PCR仪(LightCycler480 Ⅱ，瑞士Roche公司);无创肺功能检测系统(MaxⅠ 1420，美国 Buxco公司);凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)，电泳仪电转移装置(PS600，美国Hoefer公司);光学显微镜(DM4000B，美国Leica);全波长酶标仪(MD Spetramax Plus384，美国Molecular Devices公司)。

1.2方法

1.2.1PM 2.5的收集和制备 2017年8-12月于人口密集、附近无工业污染的北京市区采集大气PM 2.5样品，粒径≤2.5 μm，样品收集于石英纤维滤膜上，采样前和采样后恒温干燥24 h。将载有样品的滤膜剪成3 cm×4 cm大小，浸泡于MilliQ水中，超声震荡洗脱3次，每次30 min。以6层医用纱布对洗脱液进行过滤2次，滤液经真空冷冻干燥后收集于密闭玻璃容器中-80 ℃冻存。……