王东旭，王 虎，樊海宁，王海久，王志鑫，汤 锋，廖梦姣，王 强

(1.青海大学附属医院肝胆胰外科，青海 西宁；2.青海省包虫病研究重点实验室，青海 西宁；3.青海省卫生和计划生育委员会，青海 西宁；4.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁)

包虫病是棘球绦虫感染引起的一种严重的寄生虫疾病。但是目前，有关泡型包虫病的免疫机制还不是十分清楚。巨噬细胞(Macrophage，Mφ)主要来源于骨髓前体细胞，在机体固有免疫应答和适应性免疫应答中发挥极其重要的作用，与炎症反应、免疫防御密切相关。目前研究发现，在不同的微环境中，巨噬细胞可以分化为不同细胞亚群：主要包括M1型，即经典活化巨噬细胞；M2型，即替代活化巨噬细胞[1-4]。两种不同表型的巨噬细胞在不同的疾病中也发挥着不同的作用，M1型主要分泌各种炎症因子如IL-6、TNF-α、IL-12等促进炎症反应、清除病原体等；M2型主要分泌一些抑炎因子如IL-10、TGF-β1等参与抗炎反应、促进组织修复等，同时也有研究表明其与寄生虫在体内存活密切相关[5-8]。

本研究为了初步探讨M1/M2巨噬细胞在肝泡型包虫病中的作用，检测了泡型包虫病模型小鼠的外周血及腹腔巨噬细胞中M1/M2巨噬细胞及相关因子的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6周龄BABL/C小鼠(SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司合格证号：SCXK(京)2012-0001)。实验组每只小鼠腹腔接种25%原头节300 μL(原头节从感染泡型包虫病的蒙古长爪沙鼠中提取)，对照组每只小鼠腹腔注射等量生理盐水。

1.1.2 实验主要器材

5810R型离心机(Eppendorf公司)；BB150型培养箱(Thermo公司)；流式细胞仪(BD 公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；电子天平(上海闵桥仪器有限公司)；荧光显微镜(Olympus公司)；纯水制备器(Thermo公司)。

1.1.3 主要试剂

小鼠IL-6、IL-10、TNF-α、TGF- β1 ELISA试剂盒(abcam公司)。CD16/32(CD16/32及同型抗体结合的荧光素为BV421)、CD206(CD206及同型抗体结合的荧光素为Alex647)流式抗体及同型抗体(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 腹腔巨噬细胞的分离与纯化

随机选取小鼠，向腹腔注射预冷的不含胎牛血清的DMEM培养液5 mL。轻揉小鼠腹部2～5 min，静置5～10 min后将小鼠处死(颈椎脱臼法)，收集腹腔灌洗液，并重复灌洗两次。将三次回收的灌洗液离心(5min，4℃，500g)，所得细胞沉淀用预冷EMEM培养液洗涤两次后离心(5min，4℃，500g)，弃去上清液，将沉淀细胞再加入预冷DMEM培养液(0.1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清)重悬细胞。以常规方法计数细胞，用预冷培养液调整腹腔细胞浓度至2×106/mL，然后将细胞悬液接种于24孔培养板中，1 mL/孔，置于培养箱(37℃、5%CO2、饱和湿度)继续孵育2.5 h后换液，并用DMEM培养基洗1～2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。用细胞刮轻柔将贴壁的巨噬细胞刮下，并重复灌洗两次。将回收的灌洗液离心(5min，4℃，500g)，弃上清液，将沉淀细胞重悬于1×PBS，涡旋混匀后离心(5min，4℃，500g)，弃上清液，加1×PBS 500 μL。以常规方法计数细胞，用1×PBS将细胞浓度调整至1×106/mL待用[9]。

1.2.2 巨噬细胞的形态观察

1.2.1步骤中贴壁的细胞即为巨噬细胞，在显微镜下观察巨噬细胞的形态，并且在荧光显微镜下拍照。如图1所示：巨噬细胞形态多样，呈圆形或椭圆形、长梭形、不规则形，细胞体积较大，胞浆含量丰富，有些细胞可见较长的伪足和突起。

1.2.3 瑞氏染色和巨噬细胞的纯度计算

取1滴细胞悬液滴加于洁净载玻片上，制备涂片，自然干燥，瑞氏染色后将干燥好的涂片置光学显微镜下观察，用油镜计数细胞。结果显示细胞形态多样，体积较大，胞浆丰富，内含较多颗粒，巨噬细胞的纯度大于97%。

图1 腹腔巨噬细胞(×400)

1.2.4 流式细胞技术应用

每管中加入1.2.1步骤中得到的巨噬细胞(浓度1×106/mL)100 μL。加入抗体各5 μL，室温避光孵育30 min；离心(5min，4℃，200g)；小心弃掉上清液；加入2 mL1×PBS，涡旋混匀；离心(5min，4℃，200g)；小心弃掉上清液；加入500 μL1×PBS涡旋混匀上机。

1.2.5 M1/M2巨噬细胞细胞因子的表达检测

ELISA法检测小鼠泡型包虫病模型血清中IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1的含量，严格按照说明书操作。将标准品稀释成不同浓度，依据标准品的OD值绘制标准曲线，再根据标准曲线计算出各样本的浓度(最终样本的浓度需要乘以稀释倍数)。

1.2.6 统计学处理

2 结果

2.1 流式结果

如图2、表1所示，与正常小鼠(0.25%±0.13%)相比，感染泡球蚴90天的小鼠CD16/32+(24.18%±3.60%)的巨噬细胞(M1)百分比呈增加趋势，P<0.05；与正常小鼠(0.30%±0.14%)相比，感染泡球蚴90天的小鼠CD206+(5.75%±0.45%)的巨噬细胞(M2)百分比呈增加趋势，P<0.05。

A为正常对照组与感染组CD16/32+巨噬细胞百分比；B为正常对照组与感染组CD206+巨噬细胞百分比

表1泡球蚴感染过程中M1和M2巨噬细胞百分比的变化值

Table 1 Changes in percentages of M1 and M2 macrophages during E.multilocularis infection

2.2 ELISA结果

如表2所示，IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1的ELISA结果显示：与正常对照组相比，感染组中IL-6、TNF-α、TGF-β1的含量均有不同程度增加，*P<0.05；而感染组与对照组中IL-10差异不明显，**P>0.05。IL-6分别为正常对照组0.374±0.054，感染组197.160±59.167；TNF-α分别为正常对照组0.269±0.199，感染组8.033±1.641；TGF-β1分别为正常对照组47.800±16.943，感染组95.128±13.073；IL-10分别为正常对照组0.026±0.006，感染组0.030±0.011。

表2泡球蚴感染过程中M1/M2巨噬细胞相关细胞因子的变化值

Table 2 Changes of M1 and M2-related cytokine expression in macrophages during E. multilocularis infection

3 讨论

包虫病是全球范围内危害最为严重的人畜共患寄生虫疾病之一，也是青海地区重点防治的寄生虫疾病之一。该地区包虫病呈分布范围广泛、病死率高的特点。调查显示青海地区人群包虫病患病率为0.63%，部分地区高达12.38%。研究发现[10]，囊型包虫病患者存在Th17与Treg细胞的失衡，更重要的是Nannan Pang[11]等人发现小鼠在感染泡球蚴的中晚期也存在这一现象，同时也证实可能是通过TGF- β/Smad信号通路导致Th17/Treg细胞失衡的。与其他感染性疾病相同，宿主免疫的状态对于泡球蚴在宿主体内的持续感染及生长发育过程具有决定性的影响；与肿瘤不同的是，泡球蚴作为外源性病原体具有更强的免疫原性，理应更容易被宿主免疫系统识别并杀伤，然而大量的临床泡型包虫病病例证实：泡球蚴感染人体后能有效躲避宿主正常免疫系统的杀伤作用而在宿主体内生长发育并造成继发损伤。目前我们对包虫病缺少有效的早期检测手段，原因是有关棘球绦虫是如何有效逃避宿主正常的免疫杀伤机制而在人体内长期存活并造成严重的病理损害的免疫机制尚不清楚，故深入研究棘球绦虫感染后的免疫逃逸机制有助我们对该疾病进展过程中关键环节的了解，为后期寻找相应有效防治措施奠定基础。

巨噬细胞作为机体免疫系统重要的组成部分，在免疫防御、免疫应答等方面均发挥重要作用。巨噬细胞具有可塑造性，在不同的刺激因子作用下可以极化为功能不同的M1巨噬细胞和M2巨噬细胞[12]。研究发现巨噬细胞参与不同寄生虫感染过程。Jifeng Zhu[13]等在研究感染血吸虫的小鼠时发现，不同感染阶段M1/M2巨噬细胞的百分比发生了改变，提示血吸虫感染过程存在巨噬细胞的表型转换[14]。Rajeev Kumar Pandey[15]等通过实验证实上调巨噬细胞中Bcl-2的表达有利于利什曼原虫的存活。另一项研究表明疟疾患者通过抗Tim-3治疗可以下调单核-巨噬细胞中Tim-3的表达，这有利于机体内疟原虫的清除[16]。

本研究采用小鼠泡型包虫病模型，讨论小鼠在感染棘球绦虫90天后M1/M2巨噬细胞的变化。其中，通过流式细胞技术检测小鼠腹腔巨噬细胞CD16/32及CD206表达情况；通过ELISA检测小鼠外周血M1/M2相关细胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1)的表达情况。CD16/32和CD206阳性率的大小分别反映了M1/M2巨噬细胞含量的高低；IL-6、TNF-α表达高低反映M1巨噬细胞的多少；IL-10、TGF-β1表达高低反映M1巨噬细胞的多少。

通过流式实验结果可以看出，与对照组相比，感染组CD16/32+及CD206+的巨噬细胞均有不同程度的增加；而ELISA实验结果显示，除IL-10外，IL-6、TNF-α、TGF-β1均有不同程度的增加，说明小鼠在感染棘球绦虫90天后，宿主一方面通过上调M1巨噬细胞的表达，分泌如IL-6、TNF-α等促炎物质发挥促炎作用，帮助机体清除病原体；另外一方面，泡球蚴可能通过表达某些物质作用于宿主免疫系统，使M2巨噬细胞表达上调，分泌IL-10、TGF-β1等因子，帮助棘球绦虫逃避宿主免疫系统的杀伤作用。二者处于一个动态平衡，当二者失衡，就会引起机体杀伤或者保护寄生虫。为了进一步阐明泡球蚴感染后M1/M2巨噬细胞变化，一方面我们需要进一步扩大样本量，另一方面我们需要从不同的时间点收集实验数据动态观察M1/M2巨噬细胞的变化。