曹 圣，热增才旦，李永平，吴 萍，童 丽，包天佑

(青海大学医学院，西宁 810001)

五子衍宗方出自明代张时彻撰写的《摄生众妙方》[1]，方由菟丝子、枸杞子、车前子、覆盆子、五味子五味药组成，具有补肾益精的功效。其在临床上常用来治疗精液异常、少弱精子的男性不育[2]，但鲜有五子衍宗方治疗糖尿病性勃起功能障碍的研究。为了探讨五子衍宗方治疗糖尿病性勃起功能障碍的疗效及机制，本实验采用DM(糖尿病)性ED(勃起功能障碍)大鼠模型，以五子衍宗方及其拆方为干预措施，对五子衍宗方是否会影响生精细胞凋亡及NO-cGMP通路而改善DM性ED大鼠的生殖及勃起功能进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

2月龄雄性SD大鼠100只(均有正常的性功能，交配试验证实)，体重200±20 g，由西安交通大学实验动物部提供，动物许可证号：SCXK(陕)2012-003。按随机数字表法将实验动物分为正常对照组、模型组、涩精组(拆方I号)、补肾组(拆方II号)及全方组(五子衍宗方干预组)，每组10只。

1.2 药物选择

五子衍宗方干预组处方：菟丝子40 g，枸杞子40 g，覆盆子20 g，五味子5 g，车前子10 g；拆方I号处方：覆盆子20 g，五味子5 g；拆方II号处方：菟丝子40 g， 枸杞子40 g，车前子10 g。药材均购自青海省中医院，由青海大学医学院药学系鉴定为正品。全方及拆方按比例称重、混合，煎煮之前浸泡30 min，然后分别煎煮两次，每次2 h，合并煎液，滤过，滤液分别减压浓缩至0.108、0.023、0.085 g/mL，保存(4℃)备用。

1.3 主要试剂与仪器选择

链脲佐菌素(STZ)，Sigma公司生产；阿朴吗啡(APO)，Sigma公司生产；OneTouch SelectSimple血糖仪，上海强生医疗器械有限公司生产；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司生产；一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒、蛋白定量测试盒(双缩脲法)，南京建成生物工程研究所生产；大鼠(Rat)环磷酸鸟苷(cGMP)ELISA检测试剂盒，北京博奥拓达科技有限公司生产；TGL-16台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产；RT-6500酶标仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司生产；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产；RM6240生物信号采集系统，成都仪器厂生产。

1.4 DM性ED大鼠模型的建立及分组

1.4.1 DM大鼠模型的建立

大鼠适应性饲养1 w后，随机选出10只作为正常对照组，其余大鼠禁食24 h，称重，按40 mg/kg于左下腹腔内注射STZ溶液(将STZ在冰浴中溶于pH4.0、浓度0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，配置成浓度为10mg/mL的STZ溶液)。72 h后取尾静脉血测血糖，血糖值>16.7 mmol/L者视作造模成功。

1.4.2 DM性ED大鼠模型的建立及分组

APO勃起试验：自注射STZ溶液2 w后，将DM大鼠放在观察箱中适应环境10 min，调暗室内灯光，仅够观察即可，保持安静，之后在每只大鼠颈项松弛皮肤处注射APO溶液(APO 5mg，维生素C 250mg，生理盐水500mL，APO浓度为10μg/mL)100 μg/kg，立即观察30 min，记录阴茎有无勃起及勃起次数。大鼠龟头充血及暴露末端阴茎体为阴茎勃起一次，未见勃起者为DM性ED模型大鼠。将成模大鼠随机分为涩精组、补肾组以及全方组。

1.5 实验

正常对照组及模型组均灌服等体积的蒸馏水；涩精组灌服拆方I号药液[0.23g/(kg·d)]，补肾组灌服拆方II号药液[0.85g/(kg·d)]，全方组灌服五子衍宗方药液[1.08g/(kg·d)] ；各组每天灌服1次，连续30 d。

1.6 指标检测

1.6.1 阴茎勃起功能检测

治疗30 d后，用10%的水合氯醛(0.2mL/100g)对大鼠行腹腔注射麻醉，固定，分离右侧颈总动脉，将22 G针头(充满250U/mL的肝素溶液)穿刺颈总动脉并连接压力检测系统，记录平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)。暴露下腹正中切口，游离海绵体神经，剪开覆盖在阴茎根部的皮肤暴露双侧阴茎脚，然后分离阴茎根部，用预充满肝素溶液的22 G针头插入左侧阴茎海绵体，针头另一端连接压力检测系统，再将压力检测系统上的双钩银丝电极勾住一侧海绵体神经，刺激参数：5 ms，15 Hz，5 V。持续单刺激，刺激持续时间1 min，间隔5 min，重复3次，取平均值，记录阴茎海绵体内压(intracavernosal pressure，ICP)。

1.6.2 生精细胞凋亡的检测

大鼠麻醉后用颈椎脱臼法处死，取一侧睾丸速入4%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片(5μm)，按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作检测。以细胞核呈棕黄色为TUNEL染色阳性。参照Yin[3]的方法在显微镜(×100)下任选10个视野计数10个生精小管中的总细胞数及阳性细胞数，计算出生精细胞凋亡指数(生精细胞凋亡指数AI=生精细胞凋亡数/总生精细胞数)。

1.6.3 一氧化氮合酶(NOS)的检测

1.6.4 环磷酸鸟苷(cGMP)的检测

取上述匀浆后获得的上清液10 μL按照大鼠(Rat)环磷酸鸟苷(cGMP)ELISA检测试剂盒说明书操作测定。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠ICP、MAP、ICP/MAP对比结果

结果显示MAP在各组无明显差异(P>0.05)，涩精组、补肾组、全方组ICP、ICP/MAP明显高于模型组(P<0.01)，但均低于正常组(P<0.01)；补肾组ICP、ICP/MAP要明显高于涩精组(P<0.01)，全方组要明显高于补肾组(P<0.01)。涩精组、补肾组与全方组勃起功能明显恢复，见表1。

2.2 TUNEL染色结果

正常对照组生精细胞凋亡较少，主要为精原细胞。模型组生精小管内生精细胞大量减少，且可见严重的生精细胞凋亡，各级生精细胞均可见凋亡细胞，部分生精小管仅剩一层精原细胞。涩精组、补肾组及全方组生精细胞较模型组明显增多，但涩精组TUNEL阳性细胞主要为精原细胞、初级精母细胞以及精子细胞，补肾组主要为精原细胞和初级精母细胞，而全方组则主要为精原细胞，见图1。

Table 1 Comparison of ICP，MAP and ICP/MAP among various

*：与模型组比较，P<0.01；#：与正常组比较，P<0.01；△：与涩精组比较，P<0.01；▲：与补肾组比较，P<0.01.

图1 TUNEL法检测生精细胞凋亡图(×400，箭头所指为TUNEL阳性细胞)

各组大鼠生精细胞凋亡指数结果显示，治疗后涩精组、补肾组、全方组生精细胞凋亡指数明显低于模型组(P<0.01)，但仍高于正常对照组(P<0.01)，全方组要低于涩精组及补肾组(P<0.01)，而涩精组与补肾组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

Table 2 Comparison of AI among various

*：与模型组比较，P<0.01；#：与正常对照组比较，P<0.01；△：与涩精组比较，P<0.01.

2.3 各组大鼠总NOS、iNOS(诱导型NOS)、cNOS(结构型NOS)、cGMP(环磷酸鸟苷)比较结果

结果显示治疗后涩精组、补肾组、全方组总NOS、iNOS、cNOS、cGMP与模型组相比均显著增高(P<0.05)，但仍低于正常对照组(P<0.05)。其中，补肾组总NOS、iNOS、cNOS、cGMP又要高于涩精组(P<0.05)，全方组又要高于补肾组(P<0.05)，见表3。

组别n总NOS(U/mgprot)iNOS(U/mgprot)cNOS(U/mgprot) cGMP(nmol/L)正常组100.87±0.110.50±0.080.44±0.08 7.87±1.18模型组100.25±0.11#0.14±0.05#0.11±0.04#2.95±1.02#涩精组100.42±0.12*#0.24±0.06*#0.19±0.10*#4.59±1.21*#补肾组100.60±0.15*#△0.31±0.06*#△0.27±0.09*#△5.72±1.10*#△全方组100.75±0.11*#△▲0.39±0.07*#△▲0.36±0.08*#△▲6.80±1.30*#△▲F 42.657 41.467 26.779 26.987P 0.000 0.000 0.000 0.000

*：与模型组比较，P<0.05；#：与正常组比较，P<0.05；△：与涩精组比较，P<0.05；▲：与补肾组比较，P<0.05.

3 讨论

3.1 五子衍宗方治疗糖尿病性勃起功能障碍的中医理论

糖尿病属中医中消渴范畴，消渴日久，耗气伤阴，致肾虚精亏，而阴又损及阳，致肾阳虚衰，气滞血瘀，阳举不能，即致阳痿。五子衍宗方由菟丝子、枸杞子、车前子、覆盆子、五味子五子组成，凡子皆坚实，多能补中，况有酸收之力，自能补五脏之阴而益精气，凡子皆重，多能益肾[4]；菟丝子、枸杞子为君药，补肾壮阳，覆盆子、五味子为臣药，益肾涩精，车前子利水通淋，五药相配，补肾益精之功更甚。用五子衍宗方治疗糖尿病性勃起功能障碍是利用其补肾阴、健肾阳、行气活血，符合糖尿病性勃起功能障碍阴阳两虚、气滞血瘀病机。

3.2 五子衍宗方及其拆方对糖尿病性勃起功能障碍生精细胞凋亡的影响

生精细胞凋亡在精子发生的过程中起着重要的作用，主要体现在4个方面：(1)它能保持生殖细胞与支持细胞的最佳比率。每个支持细胞仅能供有限的生殖细胞发展成精子，故而超过合适数量的精原细胞可能就会发生凋亡而维持最佳的比例[5]。(2)通过凋亡能清除异常生殖细胞，特别是染色体异常的生殖细胞[6]。(3)支持细胞之间紧密连接形成血睾屏障需要清除过度的生殖细胞，通过抑制凋亡诱导基因bax的表达来抑制生殖细胞凋亡，而阻止了支持细胞紧密连接的形成[7]。(4)在哺乳动物接近青春期时，生殖细胞会发生大量凋亡，而抑制这种凋亡过程时，将会伴随大量异常精子的产生而导致不孕[8]。糖尿病使睾丸组织结构发生病变，生精细胞大量死亡，精子严重减少，生精细胞凋亡增多。本实验结果表明，涩精组、补肾组、全方组的凋亡指数虽然仍高于正常对照组，但明显低于模型组，且睾丸生精小管的病变明显改善，以全方组最为明显。其中，全方组的凋亡指数又低于涩精组与补肾组，而涩精组与补肾组的凋亡指数则无明显差异。可见，五子衍宗方及其拆方均能抑制生精细胞的凋亡，且均能对睾丸组织起到一定的恢复作用，而五子衍宗方拆方I、II组的功效不如五子衍宗方全方。

3.3 五子衍宗方及其拆方对糖尿病性勃起功能障碍NO-cGMP通路的影响

NOS催化人体内L-精氨酸产生的NO在阴茎勃起过程中是最为重要的一种介质[9]。NO扩散入阴茎海绵体平滑肌细胞内，活化可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，将三磷酸鸟苷(GTP)催化为cGMP，cGMP又通过蛋白激酶G途径使细胞内的Ca+浓度减小，导致阴茎海绵体平滑肌细胞舒张，海绵体血流量增多，从而引起阴茎勃起[10-11]。糖尿病能够使cGMP生成减少，弱化NO-cGMP通路对阴茎勃起的影响，从而影响勃起功能[12-13]。ICP测定是判断阴茎勃起功能的金标准[14]，而ICP/MAP能够减少外周循环血压的影响，提高准确性[15]。本实验通过检测各组大鼠的ICP、ICP/MAP得出涩精组、补肾组、全方组大鼠的勃起功能明显恢复，其中补肾组的勃起功能要好于涩精组，而全方组的勃起功能要好于补肾组。涩精组、补肾组、全方组的总NOS、iNOS、cNOS活力、cGMP含量均明显高于模型组。其中，补肾组的总NOS、iNOS、cNOS活力、cGMP含量要高于涩精组，而全方组要高于补肾组。可见，涩精组、补肾组、全方组能提高NOS活力使NO生成增多，cGMP含量也相应增加，从而通过NO-cGMP通路改善勃起功能。

综上所述，五子衍宗方及其拆方能通过改善睾丸组织病变、减少生精细胞凋亡而改善DM性ED大鼠的睾丸生殖功能。五子衍宗方及其拆方能通过提高总NOS、iNOS、cNOS活力、cGMP含量而改善DM性ED大鼠的勃起功能。