朵红,张学勇,马怡隽,付永,沈秀英,郭志宏,更求久乃,马国柱,王小红,李剑,宋仁德,陈有录,林芳明,王欣玥

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016；2.青海省称多县兽医站，称多 815100；3.青海省祁连县兽医站，祁连 810400;4.青海省贵南县兽医站，贵南 813100；5.青海省玉树市兽医站，玉树 815000)

棘球蚴病(Echinococcosis) 又称包虫病(Hydatidosis)，由寄生在狐狸、犬和狼等终宿主的棘球绦虫(Echinococcus)成虫排出的虫卵，污染环境，动物和人误食后，虫卵在体内孵化成幼虫引起的一种严重的人畜共患寄生虫病。棘球蚴病在世界范围内流行[1-3]，我国是发病率较高的国家之一，西北地区的广大农牧区是我国包虫病的主要流行区，尤其是青藏高原。由于其特殊的生态环境和气候条件，牛、羊等家畜是广大牧民群众赖以生存的基础，同时，青藏高原也是野生动物繁衍生息的场所。棘球绦虫在人、家畜、野生动物之间混合感染，形成特殊的生活史循环链。青藏高原不仅是世界上棘球蚴感染较高的地区，而且有些地区细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫混合感染[4,5]。

青海省分布着三种狐狸即赤狐、沙狐和藏狐[6,7]。在生态系统中它们与许多啮齿类、兔形目等动物构成了多房棘球绦虫的循环链[8]；藏狐和高原鼠兔间构成石渠棘球绦虫的循环链[9]。在青海省的牧区，野生狐狸活动范围与家畜的牧场重叠，野生狐狸排出的粪便污染草原环境，牛羊等草食动物采食被虫卵污染的牧草、水源后，感染上棘球蚴病。随着国家野生动物保护法的实施，野生狐狸数量增加，狐狸又是多房棘球绦虫的主要重要终末宿主，为进行棘球绦虫野生宿主的防治，对野生狐狸棘球绦虫感染调查显得尤为重要。

为掌握青海省野生狐狸棘球绦虫感染状况，我们应用棘球绦虫粪抗原检测试剂盒，对收集于青海省称多县、贵南县、祁连县的野生狐狸粪便进行了检测。

1 材料与方法

1.1 样品

于2018年4月至2020年4月，在青海省称多县收集狐狸粪便129份，祁连县收集狐狸粪便84份，贵南县收集狐狸粪便47份。

1.2 试剂盒和仪器

1.2.1试剂盒

棘球绦虫粪抗原检测试剂盒(酶联免疫法)，天禾生物技术研究院(珠海)有限公司生产，批号：110200402，生产日期：2020年4月2日。

1.2.2仪器

多功能酶标仪(SYNERGY2,美国BioTek公司生产)。

1.3 方法

1.3.1样品处理

实验前，需将粪样置于-80℃冻存至少15d以上。取粪样约1g放入盛有1mL样品稀释液的试管中，振荡使粪样混悬，3000rmp离心10min，取上清进行检测。如离心后不能吸取上清的粪样，可增加1mL稀释液重悬后再离心。

1.3.2夹心ELISA检查法

取出试剂盒平衡至室温，包被板孔中加入处理后样品100uL。阳性对照、阴性对照各加1孔，临界对照加3孔，留一孔不加样品作为空白对照。置37℃ 6min。洗板机洗板3次，洗板结束将微孔板倒置在吸水纸上拍干。每孔加酶标记物50uL，置37℃ 30min。洗板3次，每孔加显色液A/B各50uL，震荡混匀，置37℃ 避光30min。每孔加入终止液50uL(1滴)，混匀后用酶标仪读数。以空白孔调零，450nm波长测定OD置。

1.3.3结果判定

实验成立条件是阴性对照OD值<临界对照OD值平均值，临界对照OD值平均值>0.15，阳性对照OD值>0.50，证明实验成立，否则实验结果无效，需重新实验。结果判定,阴性：样品OD值/临界对照OD值平均值<1.0，阳性：样品OD值/临界对照OD值平均值≥1.0

2 结果

用于试验的3个试剂盒阴性对照OD值分别为：0.196,0.107，0.066，临界对照OD值平均值分别为：0.379，0.404，0.315，阴性对照OD值<临界对照OD值平均值，临界对照OD值平均值都>0.15，阳性对照OD值分别为：3.766，3.478，3.222，阳性对照OD值>0.50，试验成立。

称多县收集的129份狐狸粪便，经棘球绦虫粪抗原检测试剂盒检测15份阳性，阳性率11.6%；祁连县收集的84份狐狸粪便，经棘球绦虫粪抗原检测试剂盒检测3份阳性，阳性率3.6%；贵南县收集的47份狐狸粪便，经棘球绦虫粪抗原检测试剂盒检测0份阳性，阳性率0。经棘球绦虫粪抗原检测试剂盒检测的共260份狐狸粪便中阳性18份，平均阳性率7.5%。

表1 棘球绦虫粪抗原检测试剂盒检测结果

3 讨论

粪抗原检测法操作简便、方便易行、敏感性高，是目前棘球蚴病防治效果考核的重要方法，已在实践中应用多年，但用该方法检测野生动物粪便的报道较少。对收集于青海省3个地区的260份狐狸粪便，用棘球绦虫粪抗原检测试剂盒检查出阳性粪便18份，阳性率7.5%，3个地区中称多县收集的狐狸粪便阳性率最高达11.6%，祁连县收集的狐狸粪便阳性率较低为3.6%，贵南县收集的狐狸粪便中没有发现阳性。称多县收集的狐狸粪便阳性率大于其它2个地区。王虎等[10]1995—2005年在青海省青南高原区调查124只狐狸，27只感染棘球蚴，感染率21.8%，祁连山地和河湟谷地区调查24只狐狸，9只感染棘球绦虫，感染率37.5%。我们于2011—2012年收集解剖青海省海晏县、贵南县、称多县、刚察县36只狐狸，4只感染棘球绦虫，感染率11.1%[11]。李清德等[12]对民和县南大山林区收集的狐狸和狼的粪便用犬粪包虫抗原检测 ELISA试剂盒进行了检查，结果狐狸粪阳性率为27.5%。说明青海省野生狐狸上棘球绦虫感染率较高，在棘球蚴防治中应加强野生终末宿主的防治。

棘球绦虫粪抗原检测试剂盒的微孔板表面包被的是抗细粒棘球绦虫单克隆抗体，可以与被检样品中的细粒棘球绦虫抗原形成抗体—抗原复合物，加入抗细粒棘球绦虫单克隆抗体酶标记物，形成免疫复合物，加入显色液后发生颜色反应，颜色的强度与待测样品中的棘球绦虫抗原的含量成正比。该检测方法应用细粒棘球绦虫单克隆抗体进行检测，对多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫也应该有较高的检出率。有报道显示粪抗原检测方法对2种棘球绦虫(细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫)的鉴别准确率为87%～95%[13]。由于青海省存在细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫的感染，下一步，我们将对检测结果为阳性的粪便进行PCR检查和LAMP检测，以综合评价粪抗原检测试剂盒对青海省野生狐狸粪便棘球绦虫感染的检查效果。