叶健明，石宁蕙，周建中，杨海燕*

（新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

鹰嘴豆（chickpea）是世界第二大消费豆类，产量居世界豆类第三，是目前世界上栽培面积较广的食用豆类作物之一[1]。目前，中国对鹰嘴豆的食用以干制和鲜食为主，对鹰嘴豆蛋白的利用较少。鹰嘴豆蛋白富含人体所需的18种氨基酸，且必需氨基酸种类齐全、组成均衡[2-3]，NEWMANCW等[4]研究发现，鹰嘴豆蛋白的功效比值在2.8左右，消化率79%～88%，与大豆蛋白相似，是一种优质植物蛋白。应用蛋白酶水解蛋白质，可有效增强原料蛋白的生理功效，提高人体吸收。近年来，研究者依靠酶解技术从多种蛋白原料中获得降血压[5-6]、降血脂[7-8]、抗氧化活性[9-10]的小肽产物。生物活性肽的获得离不开对酶促反应进程的研究，研究其酶解动力学可有效控制酶解过程，进而提高生物活性肽得率，控制酶解成本。

植物蛋白酶解动力学的研究主要集中在荞麦蛋白[11]、小麦面筋蛋白[12]、豌豆分离蛋白[13]、大豆蛋白[14]、青稞蛋白质[15]。而鹰嘴豆蛋白酶解动力学鲜有报道，为了得到鹰嘴豆蛋白酶解最优的条件，更好地拟合实际生产条件，使其最大限度发挥酶促反应的高效性，了解酶促反应的作用机理[16-17]，需要对酶促反应的速率进行研究，因此，研究鹰嘴豆蛋白的酶解动力学具有重要的理论研究和实际应用价值。试验以碱溶酸沉提取的鹰嘴豆蛋白为原料，从酶解反应机理出发，结合数学模型的拟合和验证，建立鹰嘴豆蛋白的酶解反应动力学模型，模拟反应进程，旨在为鹰嘴豆生物活性肽的酶解制备提供可量化的、准确的控制方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹰嘴豆：木垒县鹰哥生物科技有限公司；鹰嘴豆蛋白：实验室自制；石油醚（沸点30～60℃）：天津市致远化学试剂有限公司；碱性蛋白酶（Alcalase2.4L，酶活2.65×105U/g）：丹麦Novozymes公司；牛血清蛋白、福林-酚试剂：北京市索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1200型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；HH-S4数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；AL204天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂；FW-100高速万能粉碎机：北京市永光明医疗仪器厂；PHS-3CPH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；CHRIST冻干机ALPHA 1-2LDPlus：北京五洲东方科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鹰嘴豆蛋白的制备

脱脂鹰嘴豆粉（石油醚脱脂，万能粉碎机粉碎，过80目筛）→碱溶（料液比1∶10（g∶mL）、30 ℃、90 min、pH 10.0）→离心（3 500 r/min，25 min）→上层清液→酸沉（pH4.5）→离心（4 000 r/min，10 min）→真空冷冻干燥[18]。

1.3.2 鹰嘴豆蛋白酶解反应

鹰嘴豆蛋白与水按一定比例（g∶mL）混合均匀，水浴锅中90℃预处理10 min，冷却后加0.5 mol/L NaOH溶液调至酶解最适pH，55℃搅拌至pH稳定后加入酶水解，反应结束后90℃灭酶10 min，在4 000 r/min条件下离心10 min，取上清液放入冰箱冷藏备用。

1.3.3 酶活力测定

酶活力的测定采用改进的Folin-酚法[19]。

称取碱性蛋白酶1.0 g，然后用硼酸缓冲溶液（pH=10.5）溶解并稀释到一定浓度，加入1 mL（10.0 g/L）酪蛋白溶液于40℃下反应10 min，加入2 mL三氯乙酸溶液（65.4 g/L）终止反应。取1 mL上层清液，加入5.0 mL（42.4 g/L）Na2CO3溶液混合均匀后加入1 mL福林酚试剂（福林酚与水体积比1∶2配制）。在波长680 nm处测定吸光度值。

1.3.4 水解度的测定

水解度（degree of hydrolysis，DH）的测定采用pH-Stat法[20]。计算公式如下：

式中：DH为水解度，%；B为碱液体积，mL；Nb为碱液当量浓度，mol/L；∂为氨基的解离度；Mp为底物中蛋白质总量，g；Htot为底物中蛋白质中肽键总数，mmol/g。（鹰嘴豆蛋白Htot=7.22）。

2 结果与分析

2.1 酶解反应机理和动力学模型的推导

蛋白质酶法水解反应符合双底物顺序反应机理[21-23]。

由Henri中间复合物学说可得（1）、（2），式中：E为碱性蛋白酶；S为底物；ES为复合物；P为产物；k1，k-1为速度常数。

在水溶液中，第二步反应为限速步骤，并且逆过程可忽略。由酶促水解反应速率决定其不可逆反应阶段的速率，应速率用R来表示，S0代表初始底物浓度，可得

酶解反应过程中，产物和底物的抑制可导致蛋白酶在酶解过程中失活，失活机制如（4）所示（其中Ea表示具有活力的蛋白酶，Ei表示钝化的蛋白酶，kd为抑制常数）

则上述反应过程的动力学方程式为（e表示总蛋白酶）

将方程（3）与方程（5）相除，可得到方程（6）

蛋白酶在水解体系中以游离状态E和复合物ES的形式存在，游离状态和复合物的和应当是总蛋白酶。因此得到方程（7）

根据Briggs-Haldane假设：实际上，许多酶的催化常数很高，即ES分解为产物这个过程对酶反应速度的影响不能忽略[24-25]。

稳态通常在反应初期的数毫秒内建立，当反应进行一段时间后，可认为ES的生成速度和分解速度相同，这一假设对大多数酶促反应是合理的。当反应体系中酶与酶底复合物浓度保持不变时，则有产生的复合物与分解的复合物相等，对于反应（1）根据假设可有：

由（9）可得

将方程（9）代入方程（7），因为底物浓度远高于酶浓度，可认为 S ≈s0，则可得到方程（11）

米氏常数（Km）可以判断酶的专一性和天然底物，Km表示酶和底物之间的亲和能力，Km值越小，即达到最大酶促反应速度一半所需要的底物浓度越小，亲和能力越强，反之亦然。酶活性测定体系中一般保证Km＜＜s0，公式（11）可以简化为：

把方程（12）代入方程（6），可得：

对公式（13）两边进行积分，水解度的积分上限值为DH，下限值为0，总酶量的积分上限值为e，下限值为e0，其积分方程为：

对（14）两边进行积分可得：

将（15）简化：

通过整理方程（3）、（9）、（12）和（16），得到

方程（16）代入方程（3），则可得方程（18）

设定：

由方程（19）可知，a的大小只与酶解体系初始底物浓度和初始蛋白酶浓度有关；在恒温水解反应中，b的大小应为一个常数。则得蛋白质酶解过程中水解速率的动力学模型：

由方程（19）可知，由于k2只与水解温度有关，在恒温水解反应中k2为定值，a的大小随着初始底物浓度的上升而减小，随着初始蛋白酶浓度的上升而增大；b的大小与初始底物浓度和初始蛋白酶浓度无关，但与水解温度的高低有关，在恒温水解反应中，b的大小应为一个常数，当a为负值时，其水解速率也为负，此时鹰嘴豆蛋白无法水解[15，26]。

对方程（20）积分可得水解度与水解时间的关系方程式如下：

2.2 酶解动力学参数的确定

通过研究不同初始底物浓度和初始蛋白酶浓度对水解度的影响，来确定动力学模型中的参数。以鹰嘴豆蛋白为底物进行水解，确定初始酶解条件为：底物浓度4%，时间120 min，pH 8.0，温度55 ℃，酶添加量4 000 U/g，在此基础之上考察不同底物浓度2%（20 g/L）、4%（40 g/L）、6%（60 g/L）、8%（80 g/L）、10%（100 g/L）和酶添加量2 000 U/g（0.30 g/L）、3 000 U/g（0.45 g/L）、4 000 U/g（0.60 g/L）、5 000 U/g（0.75 g/L）、6 000 U/g（0.90 g/L）对水解度的影响。试验结果如图1，图2所示。

由图1，图2可知，在固定初始底物浓度和酶浓度的条件下，鹰嘴豆蛋白水解度随酶解时间的增加而升高，而酶解速率逐渐降低，其原因可能是随酶解时间的增加，底物中的蛋白质易被水解的肽键数量减少和酶活降低[27]。当酶解时间达到60 min后，增速放缓，这可能与酶解体系中的pH改变和底物抑制有关[27]，同时蛋白酶活力会随水解时间增加而降低，相同水解时间条件下，高底物浓度水解液的水解度要低于低底物浓度的水解度，且底物质量浓度较高时，酶失活速率较快。

图1 初始底物浓度对水解度的影响Fig.1 Effect of original substrate concentration on the hydrolysis degree

图2 初始酶浓度对水解度的影响Fig.2 Effect of original enzyme concentration on the hydrolysis degree

将图1，图2的试验结果代入公式（21）进行非线性拟合，得到不同初始底物浓度（S0）和初始酶浓度（E0）所对应的动力学参数a与b，结果见表1所示。

表1 酶解动力学参数Table 1 Kinetic parameters of enzymatic hydrolysis

由表1可知，参数a随着初始底物浓度的增加而减小，随着初始蛋白酶浓度的增大而增大。动力学参数b不受初始底物浓度和酶浓度的影响，其数值在一个狭窄的范围里波动，几乎接近一个常数，这分别与已有报道大米蛋白[28]和荞麦蛋白[11]的酶解动力学参数b值的变化趋势一致。因而在本研究中，鹰嘴豆蛋白的酶解动力学参数b值用其平均值0.148表示，这与模型推导所得结论一致。

2.3 酶解反应速率常数的确定

为了得到酶解反应速率常数k2，以a为纵坐标，E0/S0值为横坐标作图，并验证方程的拟合情况，结果如图3所示。

图3 a值随着不同的E0/S0值的变化趋势Fig.3 Change trend of a value with different E0/S0 values

从图3所得到的线性关系式，y=39.522x-0.080 4，R2=0.984 0，可知a值随着E0/S0值关系曲线所对应的方程（22）：

酶解反应速率常数k2=39.522 min-1，水解速率的动力学模型：

水解度的动力学模型：

由动力学模型（23），（24）可知，水解速率随着初始蛋白酶浓度的增加而上升，但随着初始底物浓度和水解度的上升而下降。其原因可能是水解度的增大，底物中的蛋白易被水解的肽键数量减少和酶活降低，从而导致水解反应速率下降，这与图1和图2中的试验结果相符。由图3可知，a值与E0/S0值有良好的线性关系，与反应机理推导所得的公式一致，再次证明动力学模型的有效性[29]。酶解反应速率常数k2=39.522 min-1。

2.4 蛋白酶失活常数的确定

将方程（9）、（10）、（12）代入方程（5），可得：

式中：k4为水解反应过程中碱性蛋白酶的失活常数。

将a与b相乘得到关系式：

图4 ab值随着不同的E0/S0值的变化趋势Fig.4 Change trend of ab value with different E0/S0 values

由y=6.371x+0.005 2，R2=0.972 4，可知a值随着E0/S0值关系曲线所对应的方程（28）：

可知鹰嘴豆蛋白水解过程中碱性蛋白酶的失活常数为k4=6.371 min-1。

2.5 鹰嘴豆蛋白酶解动力学模型验证

为了验证上述动力学模型的准确性，将动力学模型的结果与实际水解结果进行对比。确定初始酶解条件为底物浓度3%，酶浓度4 000 U/g，pH8.0，温度55℃，结果如图5所示。

图5 实际水解度与模型预测水解度Fig.5 Hydrolysis degree of actual and predicted model

如图5所示，在水解初始阶段，试验值略低于拟合值，可能由于不同肽链长度的酶解产物对水解反应速率的抑制作用，同时底物中的蛋白质肽链解聚与肽链断裂使肽链解聚不充分，导致酶与底物结合不充分，所以拟合值比试验值略高[30]。从整体来看，动力学模型的预测值与试验值吻合较好，表明所建动力学模型对实际酶解过程具有一定的指导作用。

3 结论

（1）基于米氏方程理论，应用数学推导结合试验研究的方法得到鹰嘴豆蛋白酶解动力学模型。

（2）通过试验发现：鹰嘴豆蛋白水解过程中酶解速率随水解时间升高而降低；在一定浓度范围内，鹰嘴豆蛋白的水解度随碱性蛋白酶质量浓度的升高而增大，随初始鹰嘴豆蛋白质量浓度的升高而降低，在水解过程中同时存在产物和底物抑制现象。

（3）鹰嘴豆蛋白水解速率的动力学模型：R=（39.522E0-0.080 4S0）exp[-0.148（DH）]，水解度-水解时间的动力学模39.522E0/S0-0.080 4，b=0148。根据酶反应动力学的基本理论及相关试验结果，得出碱性蛋白酶水解过程酶失活的动力学常数Kd=6.371 min-1。通过动力学模型的验证试验，得出试验结果与模型拟合度很好，说明所建鹰嘴豆蛋白酶解动力学模型可用于指导和优化酶解工艺。