李宏梁，尉璐杰，王 欢，杜 磊，黄峻榕，孙宝国，2*，刘小晶，雷 静

（1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室，北京 100048；3.陕西宏梁食品科技有限公司，陕西 西安 710065）

纳豆是将大豆煮熟后，接种纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）（纳豆菌）后发酵形成的食品[1-2]。最先起源于中国豆豉，公元前300年流传至日本[3]。纳豆菌是美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）公认的40种益生菌之一[4]，对动物和环境安全，可以调整动物肠道的菌群平衡，提高免疫功能[5]。纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌代谢中的特征性产物，属于碱性丝氨酸蛋白酶[6]，具有高效纤维蛋白溶解活性[7]，可直接通过肠胃系统被人体吸收[6]。动物试验[8-10]和人体试验[11]均已证实纳豆激酶是用于治疗心血管疾病的安全、高效、低廉的纯天然补充剂[12]。此外，纳豆中还含有维生素K（vitamin K，VK）、大豆异黄酮、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多种生理活性成分，具有防癌、抗癌、防衰老的功效。

目前，纳豆已成为日本人日常饮食的必备食物，被认为是日本人长寿的“秘方”[13]。日本政府早在1983年就制定了纳豆的行业标准，纳豆的科学研究和食品工业均已取得了巨大成绩[14]。近年来，虽然有不少科研单位和企业已开始涉及纳豆及纳豆深加工研发，并取得了一些成果，如天津百德的冻干纳豆、北京燕京的风味系列纳豆等[13]。但由于纳豆特有的氨腥味，至今未被我国大多数人接受，且市售纳豆产品品种较少，对市售纳豆品质方面的检测鲜有报道，而关于国产鲜纳豆与进口鲜纳豆的品质对比研究未见报道，并且相比于纳豆类保健品，纳豆食品价格低廉，具有更广泛的潜在消费者[15]。所以有必要对市售纳豆产品的品质进行研究，以便了解国产纳豆与进口纳豆之间的差异，促进我国纳豆食品工业的发展。

因此，本研究以市售5种国产鲜纳豆和5种日本鲜纳豆为研究对象，对其感官、纳豆芽孢杆菌活菌数、纳豆激酶酶活力进行分析比较，旨在了解国产鲜纳豆与日本鲜纳豆在感官品质、活菌数和酶活力上的不同，为我国纳豆食品工业的发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试样品

鲜纳豆N1：珠海市售；鲜纳豆N2：青岛市售；鲜纳豆N3：北京市售；鲜纳豆N4：大连市售；鲜纳豆N5：大连市售；鲜纳豆N6～N10：日本市售。

1.1.2 主要试剂

尿激酶（1240 IU/mL）、牛纤维蛋白原、牛血凝血酶（1 BP/mL）：中国食品药品检定所；琼脂糖（分析纯）：法国Biowest公司。

1.1.3 培养基

平板计数琼脂（platecountagar，PCA）培养基：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0±0.2，121 ℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

LDZX-40Ⅱ型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；DHP-9082电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；TH-2050R台式高速冷冻离心机：上海博翎仪器设备有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：江苏金坛市宏华仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 纳豆感官评定

纳豆感官评定采用5个指标：色泽、香气、口感、拉丝、粘液[16]，纳豆评分标准：满分100分（每项各占20分），0分最差，10人双盲评定打分，然后取平均分。感官评定标准见表1[17]。每个样品重复测定3次。

表1 纳豆感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of natto

1.3.2 纳豆芽孢杆菌活菌数检测

将15～20 mL冷却至46℃的PCA培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，静置于水平操作台待其凝固；将待测样品用无菌生理盐水制成不同稀释度的样品匀液；吸取0.1 mL样品匀液于无菌平皿内，及时用涂布器将稀释液涂布均匀，每个稀释度做三个平皿。同时，分别吸取0.1 mL空白稀释液加入三个无菌平皿内做空白对照；将平板翻转，（37±1）℃培养（48±2）h。参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定纳豆芽孢杆菌活菌数。

1.3.3 纳豆激酶活力检测

本实验采用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测纳豆激酶活力[18-19]。

大概一个多星期，我的症状再次加重了。但这次没有雾霾。也没有雪。老婆再次提及去省城，我依旧拒绝。老婆不悦，说我太固执，早晚会在这方面吃亏的。我说：你少给我扯，这和我固执没关系，是因为这个冬天一直没有下雪。

纤维蛋白平板制作：取10 mL纤维蛋白原液于烧杯中，边搅拌边加入55℃琼脂糖溶液10 mL，凝血酶溶液1.0 mL，立即混匀，快速倒入培养皿中，室温水平放置1 h，冷却后放入冰箱4℃冷藏备用。

标准曲线绘制：将1240 IU/mL的尿激酶标准品用0.9%生理盐水溶液定容至10 mL，制成酶活为124 IU/mL尿激酶溶液，用生理盐水溶液依次制备成100 IU/mL、80 IU/mL、60IU/mL、40IU/mL、20IU/mL，备用。以尿激酶标准品酶活力的对数值为横坐标（x），尿激酶标准品溶圈两垂直直径乘积的对数为纵坐标（y），计算标准曲线回归方程。

供试品溶液的制备[20]：称取供试鲜纳豆样品10 g，加入0.9%的生理盐水50 mL，4℃浸提12 h，4 500 r/min冷冻离心20 min，上清液即为纳豆固体发酵粗酶液。取上清液并稀释成标准曲线范围内的浓度，按照尿激酶标准曲线回归方程计算纳豆激酶活力。

2 结果与分析

2.1 纳豆感官评定结果

按照表1对10种供试产品进行感官评定，从色泽、香气、口感、拉丝长度、粘液5个方面综合评分，结果见图1。

图1 纳豆样品的感官评分结果Fig.1 Sensory evaluation results of natto samples

由图1可知，N5和N3纳豆样品感官评分较高，分别为93分、90分。N1和N6纳豆样品感官评分较低，分别是51分、53分。综合10种市售鲜纳豆感官评定结果，大多数鲜纳豆口感酥软，粘性较强，拉丝长度＞9 cm，符合理论中对鲜纳豆组织状态的描述[17]。其中，仅有1种日本鲜纳豆（N6）口感偏硬，1种国产鲜纳豆（N1）和1种日本鲜纳豆（N10）的拉丝长度＜10 cm。

2.2 纳豆芽孢杆菌活菌数检测结果

2.2.1 纳豆芽孢杆菌的菌落与细胞形态

在进行活菌计数前，先对纳豆芽孢杆菌进行形态观察，对符合生理学形态的菌落进行计数以确保计数准确。将纳豆菌悬液涂布于PCA平板上培养48 h后，革兰氏染色并镜检，观察纳豆芽孢杆菌菌落和细胞形态，结果见图2。

图2 纳豆芽孢杆菌在PCA平板上的菌落（A）和细胞（B）形态Fig.2 Colony(A)and cell(B)morphology of Bacillus natto on PCA plate

由图2A可知，纳豆芽孢杆菌（B.natto）在PCA平板上菌落为灰白色，近圆形，表面干燥，不透明，有褶皱，无光泽，边缘不光滑成裂叶状，中间向上突起，颜色深于边缘部分。由图2B可知，纳豆芽孢杆菌（B.natto）菌体呈杆状，可观察到芽孢，长度约2.0～3.0μm，革兰氏染色呈阳性。因为纳豆芽孢杆菌（B.natto）属于枯草芽孢杆菌属（Bacillus）[21]，以理论中对枯草芽孢杆菌的形态描述[22]为参考，对符合上述纳豆芽孢杆菌（B.natto）生长形态的菌落进行计数。

由于纳豆芽孢杆菌（B.natto）具有抗氧化、降血压、溶血栓等多种生理保健功能，其活菌数含量是判定纳豆产品品质的重要指标[23]。按照1.3.2中方法对10种供试鲜纳豆产品进行纳豆芽孢杆菌活菌计数，结果见图3。

图3 纳豆芽孢杆菌活菌计数结果Fig.3 Results of viable count of Bacillus natto

由图3可知，10种市售鲜纳豆的活菌数均在1×108～3×109CFU/g之间。其中，N2和N10纳豆样品活菌数较多，分别为1.71×109CFU/g、2.96×109CFU/g；N1和N9纳豆样品活菌数较少，分别为2.43×108CFU/g、4.20×108CFU/g。

2.3 纳豆激酶活力检测结果

由于纳豆激酶具有可口服、安全性高、价格低和纤溶活力强等优势[24]，其酶活力是判定纳豆产品品质的另一重要指标。

2.3.1 尿激酶标准曲线绘制

按照方法1.3.3，以不同浓度的尿激酶标准品酶活力的对数值为横坐标（x），纤溶圈两垂直直径乘积的对数值为纵坐标（y），绘制尿激酶的标准曲线，结果见图4。

图4 尿激酶标准曲线Fig.4 Standard curve of urokinase

由图4可知，尿激酶活力在20～100 IU/mL范围内时，尿激酶活力的对数值与垂直直径乘积的对数值呈线性关系，这与谢平会等[25]的研究结果一致。直线回归方程为y=1.148 23x+0.062 86，R2=0.999 84，线性相关性良好，可用于纳豆激酶活力的测定。

2.3.2 供试鲜纳豆酶活力检测结果

图5 鲜纳豆N1～N10的纤溶效果Fig.5 Fibrinolytic effect of fresh natto N1-N10

由图5可知，10种市售鲜纳豆产品均能产生透明水解圈，这说明纳豆在发酵及冷藏运输中，并不会使纳豆激酶完全失活，且与尿激酶相比，纳豆激酶出现纤溶圈的时间至少提前2 h，即纳豆激酶的纤溶活力远大于尿激酶的纤溶活力，这与YUAN J等[26]的研究结果一致。

图6 纳豆激酶活力检测结果Fig.6 Detection results of nattokinase activity

由图6可知，N2和N10纳豆样品酶活力较高，分别为2 415.13 IU/g、1 643.77 IU/g；N1和N9纳豆样品酶活力较低，分别为406.82 IU/g、576.16 IU/g。由此可见，市售鲜纳豆中纳豆激酶活力至少可维持在400 IU/g以上，最高不超过2 500 IU/g。

3 结论

本研究通过检测5种国产和5种日本市售鲜纳豆中纳豆芽孢杆菌活菌数和纳豆激酶活力，并结合感官评定分数对国产鲜纳豆与日本鲜纳豆进行分析比较。感官评分结果表明，10种市售鲜纳豆大多数口感酥软，粘性较强，拉丝状态较好（＞9 cm），仅有1种日本鲜纳豆（N6）口感偏硬，1种国产鲜纳豆（N1）和1种日本鲜纳豆（N10）的拉丝长度＜10cm；活菌计数结果表明，10种市售鲜纳豆活菌数均在1×108～3×109CFU/g，其中活菌数＞1.5×109CFU/g的为1种国产鲜纳豆（N2）和一种日本鲜纳豆（N10）；活菌数＜1.0×109CFU/g的为1种国产鲜纳豆（N1）和1种日本鲜纳豆（N9）。酶活力结果表明，10种市售鲜纳豆中酶活力均在400 IU/g以上，其中酶活力＞1 500 IU/g的为1种国产鲜纳豆（N2）和1种日本鲜纳豆（N10）；酶活力＜600IU/g的为1种珠海鲜纳豆（N1）和1种日本鲜纳豆（N9），10种鲜纳豆中，有5种酶活力达到1 000 IU/g，其中包括3种国产鲜纳豆（N2、N3、N4）和2种日本鲜纳豆（N8、N10）。综上所述，在感官方面，国产鲜纳豆普遍优于日本鲜纳豆，在活菌数与酶活力方面，国产鲜纳豆与日本鲜纳豆差别不大，因此，我国纳豆食品工业已初具竞争力，发展前景良好。